猪瘟病毒快速检测方法研究进展

申秋平，王丽群，曹 霞，庄林林

（ 江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400 ）

猪瘟是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。CSFV为单股正链RNA病毒，与牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）和2 型（BVDV-2）、羊边界病病毒（BDV）等同属于黄病毒科瘟病毒属，基因组全长约1.25 kb，编码一个开放阅读框，其5'和3'端各有一个非编码区（UTRs）。CSFV目前已被分为3种基因型（1型、2型和3型）[1]，并可进一步分为11个亚型（1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3 和3.4）。CSFV可引起家猪和野猪感染，并可在猪群之间快速传播。猪瘟已被列为需向世界动物卫生组织通报的疫病，我国也将其列为一类传染病。近年来，随着养猪业快速发展，CSFV不断变异，导致经典猪瘟向非典型、温和型猪瘟等演变，同时临床中存在多种病原混合感染，提高了临床诊断难度。基于此，本文综述了当前国内外CSFV 快速检测方法的研究进展，以期为我国兽医工作者快速精准诊断及科学防控猪瘟提供参考。

1 基于血清学的快速检测方法

1.1 免疫层析试纸条方法

抗体检测是目前畜禽疫病快速诊断和防控措施的重要组成部分。由于目前监测抗体（Abs）的方法费时、价格较高且需要进行细胞培养和病毒操作，Xu等[2]以CSFV E2蛋白为标记抗原开发了一种免疫层析试纸用于快速检测CSFV Abs，该试纸检测血清中CSFV Abs 的灵敏度可达1∶128 000，且与其他猪病毒的Abs 无交叉反应。为实现CSFV 即时检测，Sambandam 等[3]利用CSFV 1.1 单克隆抗体开发的免疫层析方法可检测到样品中低至36.8 TCID50/mL的CSFV；且与PCR相比，该方法的敏感性和特异性分别为80.36%和87.10%。此外，为提高E2蛋白与CSFV抗体之间的亲和力，Bai等[4]基于Bac-to-Bac杆状病毒系统表达的重组E2 蛋白开发了免疫层析试纸法，灵敏度可达1∶102 400。

1.2 酶联免疫吸附试验法

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体在载体表面进行反应的一种方法。Cao等[5]基于重组CSFV E2蛋白开发了一种固相阻断酶联免疫吸附试验方法（solid-phase blocking ELISA，spbELISA）以特异性检测猪血清中的CSFV 抗体，结果表明，spbELISA法可快速检测接种CSFV C株的猪的抗体水平，且适用于大规模筛选。鉴于基于CSFV全长E2蛋白的ELISA无法区分抗CSFV和抗BVDV抗体，Ji等[6]构建了一种涵盖抗原域B、C、D、A（E2B、C、D、A）的重组CSFV E2蛋白，并以此建立了一种增强的间接ELISA方法。使用该方法未观察到抗BVDV血清的交叉反应，并显示出较高的敏感性（93.7%）和特异性（92.3%）。

使用活体标记疫苗进行接种是有效控制疫情的重要途径，但该方案的实施需以可区分感染动物和接种疫苗动物（DIVA）为基础。由于保护性免疫反应的诱导多依赖针对CSFV E2蛋白的病毒中和抗体，因此优选DIVA 策略是基于对受感染猪群中Erns特异性抗体的检测。基于此，Meyer等[7]开发了一种Erns双抗原ELISA以区分CSFV标记疫苗和野毒株，与常规CSFV E2 抗体ELISA 相比，该方法可更早地检测到血清中的抗体，且灵敏度和特异性分别达90.2%、93.8%。

为缩短CSFV 检测时间并简化步骤，Conlan 等[8]开发了一种以免疫磁珠（immunomagnetic bead，IMB）为固相载体的抗原捕获ELISA（IMB-ELISA）方法；结果表明，IMBELISA的分析灵敏度比常规ELISA高64倍，灵敏度和特异性均为100%，该方法支持目视判断，且比常规ELISA更易操作。此外，为实现经济且可靠地检测CSFV抗体，赵少若等[9]通过制备E2 蛋白单克隆抗体建立了一种CSFV 阻断ELISA 方法。结果表明，猪瘟疫苗免疫2 周后即可使用该方法检测到相应的抗体，且与BVDV无交叉反应。

1.3 化学发光检测法

化学发光检测法是基于化学反应产生的光辐射而进行分析的一种方法，具有灵敏度高、选择性好、速度快、线性范围宽等优点。麻园等[10]以E2蛋白为包被抗原建立了一种CSFV 化学发光抗体检测法，该方法可在20 min内完成血清中的CSFV 抗体检测，且具有良好的特异性和重复性。为验证CSFV 化学发光竞争ELISA 抗体检测试剂盒的应用效果，徐璐等[11]通过对2 200份血清样本进行检测，结果表明，所用试剂盒与进口试剂盒具有高度一致性，且与病毒中和试验结果接近完全一致。

1.4 生物传感器方法

随着生物、物理、化学等多学科技术的融合创新，生物传感器因其速度快、灵敏度高、特异性强等优点已越来越多地应用于病原微生物快速检测[12]。其中，磁致弹性（magnetoelastic，ME）传感器是基于磁致伸缩原理、利用两个不同磁场交叉产生应变脉冲信号以测量位置的一种传感器。Guo 等[13]利用抗CSFV IgG 构建了一种可快速检测CSFV 的高敏ME 生物传感器，该传感器的谐振频率可随CSFV 浓度的增加而增加，检测限可达0.6 mg/L，且在0～2.5 mg/L的范围内共振频率移动与浓度呈线性比例。为进一步提升CSFV检测能力，该团队还基于E2蛋白开发了一种无线ME生物传感器[14]，检测限达到2.466 μg/L，为E2抗体检测提供新的可选工具。

2 基于核酸的快速检测方法

2.1 基于逆转录PCR的方法

逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是结合RNA 的逆转录和cDNA 的PCR 反应的技术。目前已发表的研究主要基于CSFV 5' UTR、E2 糖蛋白基因以及NS非结构性蛋白基因等设计通用检测及分型引物。CSFV、非典型猪瘟病毒（APPV）和非洲猪瘟病毒（ASFV）给世界养猪业造成了巨大的经济损失。Liu等[15]建立了一种可同时检测上述3 种病毒的多重RT-PCR 方法，该方法对ASFV、CSFV和APPV具有高特异性、敏感性和可重复性，检测CSFV 的灵敏度为6.34×10 copies/μL。Rajkhowa等[16]建立了一种可同时检测CSFV、猪圆环病毒2 型（PCV2）和猪细小病毒（PPV）的三重PCR 方法，该方法灵敏度可达300 pg/反应，为猪DNA和RNA病毒混合感染快速检测提供方法参考。

巢式PCR（nested PCR，nPCR）作为PCR 的衍生技术，通过两对引物进行两轮PCR 反应实现对靶标高灵敏度和特异性检测。魏淑英等[17]根据CSFV Alfort、Brescia和C株基因组序列设计两对引物建立了一种逆转录nPCR（RTnPCR）方法，该方法可快速检测待检样品中的CSFV。吴旭锦等[18]建立的RT-nPCR 方法检测限达6.7×10-5ng/L。胡建和等[19]开发的nPCR 实现了CSFV、BVDV 和BDV 快速鉴别。此外，为缩短检测时间，Barlic-Maganja等[20]通过RT-PCR扩增CSFV RNA后在微孔板中与捕获探针杂交，并通过ELISA 对产物进行比色检测和区分，建立的RTPCR-ELISA法比常规RT-PCR灵敏度高100倍，且具有良好的特异性。

2.2 基于荧光定量PCR的方法

荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技术以快速、灵敏、特异等优点已广泛应用于微生物鉴定、基因表达分析等研究。通过将RNA 先逆转录成cDNA 或直接在反应体系中加入逆转录酶，即可实现RNA 快速定量检测。赵建军等[21]使用CSFV 通用引物和野毒株特异性TaqMan探针，建立的qPCR方法检测限低至10 copies/μL，并在108～101范围内具有良好的线性关系，此外使用该方法可在表现出猪瘟临床症状前3～4 d检出CSFV。Zheng等[22]利用SYBR green I 建立的双重qPCR 方法可同时检测CSFV 和猪圆环病毒3 型（PCV3），并表现出较高的灵敏度、特异性和可重复性。Ning等[23]基于NS2基因建立了一种高分辨率熔解曲线分析方法，可用于同时检测和区分CSFV 疫苗株和石门株。为加快核酸扩增及提高检测能力，Wernike 等[24]评估了高速qPT-PCR 在检测CSFV 中的应用性能。结果表明，高速qPT-PCR 的灵敏度为200 copies/μL，但不同PCR仪的反应时间和灵敏度略有不同。Liu等[25]基于引物-探针能量转移建立了一种qPCR方法以用于CSFV 高效检测。该方法检测限可达20 copies/反应，并具有高特异性和可重复性，通过熔解曲线分析可准确区分CSFV野毒株和疫苗株。

为优化逆转录反应以提高RT-qPCR 的灵敏度，Podgórska等[26]通过比较不同的逆转录酶、热条件和引物组合，发现使用SuperScript Ⅱ酶、非酰胺和反向、基因特异性引物可获得最佳的逆转录效果。与使用AMV酶与随机六聚体的方法相比，该组合可将RT-PCR 的灵敏度提高近1 000 倍。此外，为便于快速采样，Petrini 等[27]通过采集感染后不同时间的口腔液和血清进行检测，结果表明使用RT-qPCR 可从口腔液中检测到CSFV 的概率与血样相同甚至更高。为进一步简化样本处理过程，Nishi等[28]开发了一种免核酸提取的多重RT-qPCR 以同时检测ASFV、CSFV和猪内源基因，使用血清和组织匀浆作为样本时，该方法均显示出良好的敏感性和特异性。考虑到5' UTR 作为CSFV检测单一靶标的局限性，Leifer等[29]使用NS5A基因作为靶标，并与β-肌动蛋白检测系统联用建立了一种RT-qPCR 方法。试验结果表明，该方法检测结果可靠且独立于5' UTR，为CSFV精准检测及实验室排除5' UTR扩增产物污染提供了工具支持。

2.3 环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP 是2000 年由Notomi 等[30]发明的一种核酸扩增技术。该技术的特点是针对靶基因的6个区域设计4条扩增引物（其中两条为长引物），在链置换DNA 聚合酶的作用下，60～65 ℃、60 min 内可扩增出109～1010个靶序列，具有扩增效率高、支持目视判断等优点。Chen 等[31]基于CSFV 5' UTR开发的RT-LAMP 方法可在65 ℃、60 min内完成检测，该方法检测限可达5 copies/反应，并显示出比RT-PCR 和病毒分离更高的检测率。Yin 等[32]建立的RTLAMP 方法可在50 min 内完成CSFV 检测，且灵敏度和实际检测性能均优于常规RT-PCR。

为实现LAMP 结果可视化，Zhang 等[33]在反应体系中加入SYBR Green I，可根据反应前后颜色变化进行判断，并实现与RT-qPCR 相当的检测性能。Zhang 等[34]应用SYBR Green I 建立的可视化LAMP 方法灵敏度达5 copies/反应，并可特异性检测CSFV疫苗株（HCLV）。此外，鉴于免疫层析试纸条简单、快速、现场检测等优势，Chowdry 等[35]结合LAMP 与免疫层析试纸建立了一种可用于CSFV 快速检测的方法，使用试纸可在2～5 min 内读取扩增结果，分析灵敏度约为100 copies/反应。

2.4 基于重组酶的核酸扩增方法

重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年来发展的一种核酸等温扩增技术，可在37～42 ℃恒温条件下实现对靶序列快速扩增，具有反应条件温和、扩增效率高等优点。杨俊等[36]基于CSFV 5'端UTR 设计引物和exo 探针，建立的实时荧光RPA 方法可在30 min 内完成CSFV 检测，针对CSFV 重组质粒的检测限为8.3×102copies/μL，且具有良好的特异性。Tu 等[37]开发了一种基于荧光探针的实时反转录重组酶介导核酸扩增方法（real-time reverse transcription recombinase-aided amplification，rRT-RAA），该方法对CSFV 表现出良好的特异性和可重复性，灵敏度达2 TCID50/反应，与RT-qPCR 方法的重合率为98.5%。同时，rRT-RAA结果可通过蓝光成像仪直接肉眼观察。

为区分CSFV 野毒株和疫苗株，Zhang 等[38]联合RTRAA 和CRISPR/Cas13a 建立的快速诊断方法检测限可达3.0×102copies/μL。同时，通过引入加热未提取的诊断样品以灭活核酸酶处理方法，敏感性比抗原ELISA 高100倍。薛俊欣等[39]基于Cas13a建立的RAA-Cas13a方法将检测灵敏度提高至102copies/μL，并具有良好的特异性和可重复性。

2.5 微阵列方法

基因微阵列是近年来发展的一种分子技术，可通过成千上万个DNA 片段密集排列于硅片、玻片或尼龙膜等固相载体上，在特定条件下与样品靶序列杂交，通过荧光显微镜等设备获取图像后进行信息分析，该技术具有高效率、高通量等优势，适于大规模检测。Xia等[40]开发了一种基于四重PCR的微阵列方法，可一步法区分CSFV野毒株和疫苗株、ASFV 以及APPV；该方法对CSFV 野毒株和疫苗株的检测限分别为6.98 和6.92 copies/μL。为快速准确鉴别CSFV 的3 种基因型，Kim 等[41]开发了一种CSFV DNA芯片方法，扩增产物与芯片上的探针进行杂交后通过荧光扫描进行检测；该方法检测限可达1 TCID50/100 μL，且检测结果与序列分析结果一致。为实现多重检测，王温田等[42]将生物素标记PCR 产物后与基因芯片进行特异性逆向点杂交，通过芯片扫描实现对病原的检测和分析。结果表明，目标核酸与芯片杂交后可显示明显的阳性信号，且重复性良好。

2.6 其他快速检测方法

绝缘等温PCR（insulated isothermal PCR，iiPCR）是利用反应容器下的单一热源，通过瑞利-贝纳德对流产生温度梯度的一种PCR 方法。Lung 等[43]基于逆转录iiPCR（iiRT-PCR）技术，采用POCKIT™核酸分析仪检测来自目标特异性荧光标记探针的光学信号，实现对CSFV 高灵敏度和特异性的检测。此外，iiRT-PCR 法可从病毒接种2 d后的血清中检出CSFV，显示出其具有早期诊断应用价值。

G-四聚体DNA 酶已成为可视化DNA 检测的重要可选工具。Lu 等[44]联合比色G-四聚体DNA 酶与依赖核酸序列的扩增方法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）建立了一种可目视检测CSFV 石门株和HCLV 株的方法，该方法可在3 h 内检测到血清中低至10 copies/mL 的CSFV。随着RNA 原位杂交方法的发展，病毒RNA 分子在培养细胞或组织切片中的定量、定位和可视化成为研究致病性的重要手段。Zhang 等[45]设计CSFV 和β-actin 探针，建立了一种RNA 原位杂交方法可监测RNA 在感染细胞中的相对位置，该方法可特异性检测CSFV 1.1、2.1、2.2 和2.3 亚型，且最早可在感染后0.5 h检测到病毒RNA。此外，为提高CSFV检测效率并简化步骤，Ning 等[46]设计了一种DNA 序列共轭修饰的金纳米（CSFV-AuNP）探针以实时检测CSFV，修饰的DNA 序列能够特异性识别和捕获CSFV RNA 并产生荧光信号以实现定量分析。

3 展望

鉴于目前猪瘟越来越多地表现为非典型、温和型以及混合感染等复杂形式，实验室检测已成为猪瘟确诊的重要辅助手段。多种检测方法中，病毒分离培养结果准确，但烦琐费时，难以满足病原确认的时效性需求。基于免疫学和核酸的检测方法具有方便快速、方案设计灵活多样等优势，已成为常用的CSFV检测方法，但免疫学检测方法敏感性有待提高，且具有一定的滞后性。基于核酸的检测方法快速、灵敏、特异，且病毒核酸可以在宿主感染后更早地被检测到，但目前以PCR为代表的核酸技术或依赖存在安全威胁的电泳试验，或需使用成本较高的试剂及仪器，难以推广至资源条件有限的用户。等温扩增技术为核酸检测提供新的工具支持，但目前在引物（探针）设计、反应体系成熟度等方面仍存在一定局限性，且综合性能（包括灵敏度、特异性及可重复性等）仍有待提升。随着多学科技术的发展与融合创新，期待未来能够出现更多简单快速、成本可控且用户友好的新兴技术以更好地满足即时检测、栏边检测以及超多重检测等多样化需求。