犬皮质醇检测方法的研究进展

孙 宁，付家琳，徐 澍，俞 曦，水映懿，于广波，朱启文

（ 1. 中国刑事警察学院，辽宁 沈阳 110034 ； 2. 安徽省铜陵市公安局，安徽 铜陵 244000 ；3. 大连外国语大学，辽宁 大连 116000 ； 4. 沈阳医学院辽宁省行为认知重点实验室，辽宁 沈阳 110034 ）

皮质醇是大多数哺乳动物（包括犬）的压力标志物，可反映下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的活动[1]。大量研究证明了皮质醇测定衡量犬肾上腺皮质活动的可靠性和实用性，皮质醇在某种程度上已成为评估犬对压力反应的黄金标准，并被认为是评估犬福利状态的重要指标。皮质醇在机体内以化合物和游离的形式存在，血液循环中大部分皮质醇（超过90%）与转运蛋白结合，约80%皮质类固醇与球蛋白结合（称为CBG），10%与白蛋白非特异性结合，余下的5%~10%血浆皮质醇以未结合的生物活性形式循环，以游离状态存在，即游离皮质醇。对压力应激反应的血浆皮质醇浓度增加主要发生在游离皮质醇，只有游离皮质醇才能够对靶细胞发生作用。

游离皮质醇分子小、亲脂性强，广泛存在于身体中各处，因此血液、唾液、尿液、头发和粪便均可作为测量皮质醇的介质。在血液和唾液中，皮质醇变化可在数分钟甚至数秒钟检测到，适合监测短期压力；粪便和尿液可反映数小时甚至数天皮质醇的分泌状况；毛发样本中皮质醇水平可测量数周甚至数月的激素含量，适合监测长期压力。不同介质的皮质醇测定存在相关性，也具有相似之处和相对可行性。随着人们对犬的福利状况愈发重视，各种犬皮质醇的测定方法不断发展并逐渐完善，犬的皮质醇已经成为衡量犬压力的一种可视化检测方式。本文通过国内外对血浆皮质醇、唾液皮质醇、粪便皮质醇和毛发皮质醇等4种犬皮质醇检测方法的研究进展进行汇总，探究应用于犬的皮质醇测定方法，为改善犬的福利以及工作犬的性能提升提供参考。

1 皮质醇检测方法

1.1 血浆皮质醇

早期研究大多测量血浆中皮质醇浓度，现已趋向成熟并得到广泛应用，对于诊断和监测犬的肾上腺皮质功能异常非常重要。基于血液样本提取皮质醇是传统的测定皮质醇浓度的方法，因此血浆皮质醇测量被视为“金标准”，不仅用于评估压力反应，也被视为判断其他样本介质皮质醇浓度的标准。采集血液样本具有方便、快捷的特点，能够即时地反映特定状态下机体的皮质醇浓度。但血液取样存在一定局限性，取样过程中所采取的对犬的约束和处理可能成为压力源本身，从而影响皮质醇浓度；采用静脉抽血等损伤性手段本身会对动物造成不同程度的伤害；检材的采集、保存要求较高。因此，目前多采用侵入性较小的措施检测机体内皮质醇浓度。

1.1.1 样本采集

1.1.1.1 采集时间点（与刺激源的时间差）

一般在压力源发生10~20 min 后采血，确定该采集时间是因为犬血液皮质醇浓度遇到压力源后约20 min 达到峰值，在噪音刺激开始后约11 min 达到峰值，30 min 后恢复到基础水平。人类遇到压力源后20~40 min 达到峰值，具体的精准时间取决于压力持续时间和压力性质。

1.1.1.2 采集方法

犬头静脉静脉采血3~4 mL，血样收集到含肝素或EDTA 的试管，立即将样品置于冰上，离心收集血浆，-20 ℃储存直至分析。采血时间应尽量快，以确保皮质醇水平不会因采血过程的刺激而升高。整个采样过程需在2 min内完成，避免影响唾液皮质醇结果。

1.1.2 保存

采集后样品应立即送检，不宜长期保存，原因是标本在离体环境中时间过长，血清中的皮质醇浓度或活性可能降低。尽管室温条件下犬血浆中的皮质醇具有稳定性[1]，但在-20 ℃或更低的温度下冷冻血清或血浆是一种理想的储存方法。此外，储存过程中要避免反复冻融，商业ELISA试剂盒手册明确警告避免冻融循环，因为反复冻融样品可能会影响血清或血浆中激素的稳定性。

1.1.3 测定方法

犬皮质醇的检测方法常使用放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）和液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）等方法，以EIA 中酶联免疫吸附试验（ELISA）被广泛使用。目前测定皮质醇通常使用商业试剂盒，可用于检测血液、粪便、唾液、尿液中的皮质醇浓度。

1.2 唾液皮质醇

在犬类研究中使用唾液皮质醇很普遍，虽然血液和唾液均可作为犬急性应激的压力标志物，但通常认为唾液皮质醇测量是一种比血浆皮质醇更好的方法，因为唾液采样相对简单、非侵入性，故经常用于犬监测短期压力变化。唾液能够最准确地反映肾上腺皮质反应，主要原因是唾液皮质醇浓度直接受血浆中游离皮质醇浓度的影响，唾液中的皮质醇基本是血浆游离皮质醇在唾液腺腔腺泡细胞中被动扩散的结果[2]。皮质醇从血浆到唾液的转移非常迅速（<2 min），静脉注射的皮质醇不到1 min 就会出现在唾液中。犬唾液皮质醇浓度与血浆浓度存在强烈的正相关性[3]。但唾液采样的一个潜在缺点是唾液皮质醇浓度远低于血液，因此，测定唾液皮质醇需要采用比测定血浆皮质醇更灵敏或更合适的测量技术以及更多的唾液采集量。

1.2.1 样本采集

1.2.1.1 采集量

唾液皮质醇浓度通常约为血浆浓度的7%~10%，因而用于测定的唾液量需为血浆皮质醇测量的10倍以上，过少的样品会导致从吸收性材料中提取的皮质醇过低。为保证结果有效性，建议尽量采集多量样本，一般检测方法只需25 μL唾液即可进行皮质醇测定。

1.2.1.2 采集方法

唾液采样的方式各有不同，包括犬咀嚼拭子、拭子在犬口腔内保持不动或在不同位置（舌头、牙龈、硬腭、颊部）摩擦。文献报道了多种收集犬唾液的方法，但尚未确定一种标准操作。犬不喜欢口腔内的收集物，收集到的犬唾液量不足，为克服这个问题已尝试了几种刺激犬唾液分泌的方法。食物引诱方法刺激唾液分泌很方便，如给犬嗅闻奶酪或采用乙酸、蔗糖、氯化钠、牛肉味棉签[4]等。使用柠檬酸刺激犬唾液分泌是使用最广泛的方法，可将一些柠檬酸颗粒洒在犬的舌头上或用浸过柠檬酸的棉签擦拭犬的口腔和牙龈[5]。具体方法为：收集唾液前用浸有5%柠檬酸的棉签擦拭犬的口腔，将海绵放入口腔1 min后取出，能够吸收100~1 000 μL唾液。

但由于犬的唾液具有保护个体免受酸性物质侵害的缓冲作用，采用柠檬酸钠颗粒刺激唾液分泌会影响唾液皮质醇浓度。研究表明，仅0.1 g/mL的柠檬酸即可引起唾液pH 值显著下降，唾液皮质醇浓度显著升高。最近研究表明，蘸有生姜的棉签可强烈刺激犬唾液分泌，收集时间仅30 s（训练有素的兽医也很难将棉签放在犬口腔坚持2 min），可采集到足够量的唾液（>400 μL）[6]。

1.2.1.3 采集材料

采集材料也是影响能否收集到足够唾液的重要因素，采样过程中不仅要吸收大量唾液，还应能够回收所吸收的唾液。从犬的口腔中收集唾液的采集材料最常用的有纱布、海绵、棉签、绳子等；较常用的方法是滤纸法，一般将滤纸放置犬舌下或口腔内，直到唾液彻底浸透滤纸。但从滤纸提取皮质醇的过程较烦琐，需用乙醚从滤纸上提取皮质醇，再用二乙醚溶解、离心、蒸发、二次蒸发、加缓冲液等[7]，且样品蒸发耗时，乙醚具有副作用和毒性，需要特殊准备防毒面具、化学防溅镜等实验室安全防护设备。

一些报告称，棉质材料唾液的回收率相对较低，尤其是在从犬口腔里吸收的唾液量低的情况下。而使用聚酯纤维对吸收唾液的效果较好，能够收集唾液的（54.7±2.3）%，在离心后可以回收（95.8±1.1）%的唾液[8]。但也有报道，用棉拭子或聚酯拭子获取犬的唾液量无差异。近年来，眼海绵被认为是一种有效收集唾液用于成年人皮质醇测定的新材质，柔软无味，可收集足够的唾液进行皮质醇测定。现已有市售配套棉或聚酯拭子的特殊试管。

1.2.1.4 采集时间点（与刺激源的时间差）

目前关于唾液取样的理想时间存在一些争议。与血液相比，唾液皮质醇浓度峰值出现时间稍有延迟，Beerda等[9]却检测到唾液皮质醇浓度峰值与血浆相比没有延迟。产生差异的原因可能在于是否将全血清或血浆浓度与唾液进行比较，因为唾液仅含有皮质醇的游离部分。有研究显示，与血液中皮质醇的峰值浓度相比，唾液中的皮质醇峰值浓度滞后不到2~3 min[10]。因此一般在压力刺激21~23 min后开始采集，此时唾液浓度达到峰值。

1.2.1.5 采集时间

与采集的要求相似，整个采样过程需在4 min内完成。大部分研究认为采样时间应为30~60 s，犬能够保持安静和配合，但也有部分犬在采样过程中烦躁不安，取样断断续续。一般采集拭子固定在口腔中的一处停留而非反复摩擦（这可能使犬更兴奋），采样比较快速而顺利。

1.2.2 提取和保存

不同研究中样本的离心条件差异较大[8]，如离心速率2 800~4 000 r/min，离心时间0~45 min，离心后保存条件为冷冻-20 ℃或-80 ℃。唾液中的皮质醇相对稳定，可在室温下放置数小时甚至数天，但样品细菌生长会降解皮质醇，因此应在收集后尽快冷冻样本。唾液含有黏蛋白，在测定前冷冻样品和离心（12 000 r/min 离心10 min）可降低唾液样品的黏度，使其更容易移液，也能够避免可能存在的颗粒物质（如食物残渣）的污染。

1.2.3 测定方法

样品在室温下解冻，6 000 r/min 离心10~20 s，使用移液器从离心管底部收集唾液。由于皮质醇的唾液浓度通常比血浆浓度低10倍，若使用血浆或血清的商业试剂盒需要调整以适应唾液皮质醇。

1.3 粪便皮质醇

粪便皮质醇其实是粪便皮质醇代谢物（FCM）。因为皮质醇在肝脏中代谢快，其代谢物通过胆汁排泄到肠道中，粪便中无法发现皮质醇本身，因此使用FCM测量肾上腺皮质的活动[11]，本文中暂且称为粪便皮质醇。

粪便皮质醇测定具有很多优点，如粪便可很容易地在不侵扰犬的情况下在犬舍和自然环境中采集，采样程序对测量的皮质醇浓度无影响。此外，与采集血样相比，粪样中的皮质醇变化具有长期特征，可反映某个时间段内（犬为20~28 h[12]）的平均皮质醇浓度，而非某一时刻的脉冲值，不受某一时间点的应激条件影响。此外，粪便可长期、连续地采集，对于研究某些生理特征及动态是一种便捷有效的非损伤性方法，利于对犬的生理状况进行长期监测。

但粪便皮质醇浓度受诸多因素影响，包括在肝脏中的代谢、通过胃肠道的时间、细菌分解、食糜质量、食材类型以及样本收集、保存程序。因此，粪便样本收集和储存的标准操作程序对于检测结果至关重要。

1.3.1 样本采集

1.3.1.1 采集时间点（与刺激源的时间差）

皮质醇在粪便中的代谢有滞后性，即应激的发生与粪便中出现皮质醇代谢物之间存在滞后时间，粪便的采集时间需依据滞后时间方可相对精准地与应激压力源对应。正常情况下，粪便皮质醇与血液皮质醇浓度正相关，但二者会呈现分泌高峰时间不一致的现象。因为血液中的皮质醇在肝脏与蛋白相结合，以代谢物的形式经肾进入尿液排出或经胆汁进入肠道通过粪便排出，在肠道阶段激素又可被重吸收进入肝肠循环，整个过程使粪便中的皮质醇浓度滞后于血浆皮质醇浓度。使用放射性皮质类固醇示踪剂（如14C-皮质醇）能够准确地确定滞后时间。Schatz等[13]研究了犬的14C-皮质醇的代谢，犬粪便中皮质醇激素的峰值发生在（24±4） h后，在48 h后恢复到基础水平。

1.3.1.2 采集量

一般检测需要粪便0.2~0.5 g，但也有报告称样本量小于0.05 g时结果会产生偏差[14]。

1.3.2 保存

粪便中含有大量微生物，若不及时处理，粪样中类固醇激素的代谢产物会被自身及外界的微生物分解，样品保存应做适当处理以减少影响，比如冷冻、冷冻干燥、加热干燥、二氧化硅干燥或储存在乙醇（90%~95%）、福尔马林（10%）、乙酸（2%）和氢氧化钠（2%）中。因为水会支持细菌酶的活性，为尽量减少由于细菌作用导致的粪便样本变化，样品最好是排便后尽早收集，采集后立即冷冻、冻干，-20 ℃储存直至分析。此外，如果冷冻样品在40 ℃下缓慢解冻，与在95 ℃下更快解冻相比，皮质醇浓度会增加。

1.3.3 提取

粪便代谢物是几种具有不同极性的代谢物的混合物，在皮质醇测定之前需要进行提取。到目前为止，甲醇对皮质醇的提取率最高。Farca 等[15]分别用二乙醚和甲醇提取犬的粪便皮质醇，二乙醚和甲醇提取物的回收率分别为（23.2±2.0）%和（89.0±6.0）%。提取犬粪便皮质醇方法推荐的程序是：冷冻粪便在37 ℃培养箱中干燥72 h，因皮质类固醇在粪便中分布不均匀，故再将干粪便样本粉碎均匀。提取时首先称量一定质量的均质粪便（如0.5 g），用固定体积的80% 甲醇（如5 mL）萃取，振荡30 min，2 500 r/min离心15 min后取上层清液待测定。

1.3.4 测定方法

提取后，将样品离心20 min，取1 mL 上清液在空气流下干燥。首先加入50 μL 的100%乙醇，加入1 mL 磷酸盐缓冲液PBS，对干燥的提取物进行复溶，等待测定。有研究表明，犬粪便代谢物中的皮质醇EIA最适合监测肾上腺皮质活动的变化[16]。

1.4 毛发皮质醇

毛发皮质醇测定是一种近年流行的压力生物标志物评估方法。毛发采集非侵入性，取样轻松，价格低廉，材料来源丰富，还可常温保存至数月甚至数年，具备比其他皮质醇测定方法更多优势。如毛发皮质醇比血浆和唾液皮质醇测量的侵入性更小；比血浆、粪便或唾液中的皮质醇更能够指示长期或慢性压力源，血浆、唾液和粪便评估的是1 d 内的急性应激源，而毛发中的皮质醇含量会随着毛发的毛囊生长反映前几周至几个月的压力活动，能够评估犬的慢性压力水平；毛发采样比唾液或粪便更省力，唾液和粪便皮质醇需要在多个时间段收集更多的样本，而且4个粪便样本才能够达到1个毛发样本相同的可重复性水平，避免了重复采样，结果更稳定。

与唾液、粪便等中的皮质醇相比，毛发中的皮质醇浓度不易受到昼夜节律、个体本身或外界一些因素的影响。Bennett等[17]报道，年龄、品种、体重或绝育对犬毛发皮质醇无显著影响，支持了毛发皮质醇成为比较个体特征（如对慢性压力的恢复力）的工具。头发皮质醇在取样、测量和分析等方面的优势确保了其应用于慢性压力研究的可靠性。虽然毛发样本是一种量化长期皮质醇浓度的实用且有效的方法，但皮质醇进入毛发的机制尚不完全清楚。目前普遍被接受的是由Vassiliki 等[18]提出的假说，认为游离皮质醇会通过血液运输穿过毛细血管壁，通过被动扩散到毛囊并掺入毛干的角蛋白基质中，再沿着发轴生长方向扩散运输至发梢部位。一些研究表明，犬的毛发颜色会影响皮质醇浓度，黑色犬的毛发皮质醇浓度较低，深色毛发的皮质醇浓度低于浅色毛发，有时同一头犬身上不同颜色的皮质醇浓度也存在差异。目前认为原因是犬的黑色毛发中含有黑色素，黑色素与皮质醇等中性化合物结合较少。

最有争议的是毛发皮质醇浓度是否随着毛发的生长而变化，有研究表明，犬紧贴皮肤处（新生毛发）和毛末端（旧毛发）皮质醇浓度无差异。尽管犬毛发皮质醇检测相对处于起步阶段，但犬的毛发与唾液和粪便皮质醇浓度之间的正相关性已得到证明。Mack等[19]对从犬指甲和毛发样本中测量的皮质醇进行比较，发现这两种方法存在显著正相关。毛发皮质醇测定是衡量犬慢性压力的非常的潜力的评估方法。但目前毛发皮质醇的研究仍处于不成熟的阶段，需要深入研究。

1.4.1 样本采集

1.4.1.1 采集部位

人类的头发采样部位比较一致，位置在脑后顶点，取样尽可能接近头皮。犬的采样部位多为荐部（坐骨区）、肩部、胸部（剑突区）和腿部（内侧），同一只犬的左肩和右肩采样的毛发皮质醇浓度没有差异。

1.4.1.2 采集量及采集方法

一般使用电动剃须刀或剪刀采集犬毛发，皮质醇分析需约250 mg的毛发（最少7~50 mg）。采集毛发时，对于是否带有毛囊连根拔起尽管还存有疑议，但大部分研究的毛发样本中均不含毛囊。Gow等[20]建议不要拔毛，认为拔毛会带有毛囊，毛囊中的皮质醇可能会混淆毛干中皮质醇的浓度。毛囊本身会在局部产生皮质醇，与下丘脑-垂体-肾上腺轴全身应激反应相协调合成皮质醇[21]。

1.4.2 清洗

在检测前清洗毛发样本是一种很好的做法，旨在去除毛发外部的污染物。在不影响内部皮质醇浓度的情况下，使用异丙醇清洗2 次，每次洗涤3 min 是去除污染源的最有效方法[22]。这种预提取洗涤程序已被许多研究采用，具体方法是：称重250 mg头发样品，置入15 mL聚丙烯管中，加入5 mL异丙醇，轻轻摇动试管3 min清洗。该程序重复2次，在室温下干燥毛发样品7 d。

1.4.3 剪碎/研磨

为增加从毛干中提取皮质醇的比例，大部分研究在测定前将毛发剪碎或研磨。毛发皮质醇的提取取决于头发的粒度，粒度越高，提取的皮质醇的浓度就越高。剪碎是指将毛发的长度精细切割至约1 mm，检测结果差异性较大；而研磨则用球磨机产生细粉和均质的毛发颗粒，皮质醇水平是剪碎毛发的3.5 倍，可最大限度地提高皮质醇的提取量。因此，研磨头发是毛发皮质醇制备的优选方法。具体方法是：将50 mg 的毛发样品精细切成小段（>1~2 mm），使用球磨机（30~50 Hz，8~10 min）研磨成粉末。

1.4.4 提取

测定前必须采用有机溶剂提取毛发角蛋白基质中的皮质醇。提取通常包括将毛发粉末或片段与甲醇混合，室温和50 ℃之间孵育过夜至24 h。具体方法是将毛发样品浸入1.5 mL 的无水甲醇中（20 ℃，24 h），3 000×g 离心5 min，吸取0.6 mL 上清液，置于培养箱中孵育（50 ℃，18 h），干燥以蒸发甲醇，加入试剂盒中提供的0.2~0.4 mL缓冲液[23]。

1.4.5 测定

与唾液皮质醇的方法相似，毛发皮质醇浓度通常很低，所以测定灵敏度是测定的关键。液相色谱—质谱联用法（LC-MS/MS）在犬毛发皮质醇测定中经常使用，确定犬毛中是否存在皮质醇的“金标准”。2004年，Raul等[24]使用LC-MS/MS报告了人类头发中的皮质醇。Bryan等[25]使用了LC-MS/MS 测量犬毛中的皮质醇。具体方法为提取100 mg 毛发粉末样品，用20 μL 氘代皮质醇作为内标（每次进样800 pg），与甲醇混合，并在室温和50 °C 之间孵育过夜，加入50 μL 甲醇和50 μL 水复溶，14 000×g 离心10 min，提取40 μL注入LC-MS/MS系统。

2 影响皮质醇测定的因素

皮质醇检测结果受个体差异、检测方法程序和具体环境等因素的影响。因为皮质醇反应通过复杂的途径调节，受到个体差异、昼夜节律波动以及压力源强度和以往经历等诸多因素的影响，需要在犬皮质醇测定中加以考虑，以增加检测结果的可靠性。

2.1 昼夜节律

在人类和其他一些哺乳动物中，皮质醇浓度会受到昼夜节律波动的影响，尤其是对急性压力更为敏感的血液皮质醇、唾液皮质醇。在非压力条件下，健康成年人在早晨血浆皮质醇浓度最高，之后逐渐降低至午夜时最低，犬是否存在皮质醇昼夜波动规律尚未达成共识。

一些研究发现了犬皮质醇昼夜变化的证据，如Palazzolo[26]的研究认为，成年犬的血浆皮质醇中存在昼夜节律，但在老年犬血浆中未检测到24 h 内存在显著变化，幼犬中不存在血浆皮质醇的昼夜节律。杜凤鸣等[27]发现，犬8：00时血浆皮质醇浓度最高，12：00、16：00、20：00:逐渐下降，24：00最低，翌日4：00回升，8：00再次升至最高。

但更多的研究表明，犬血浆中可能根本不存在这种昼夜模式。有研究指出，犬似乎没有明显的昼夜皮质醇节律，在24 h 内每小时测量比格犬，并未发现犬唾液皮质醇浓度之间的差异[3]。还有研究发现，每日3 次采集结果显示犬唾液皮质醇没有出现系统性的昼夜节律差异。在持续30 d，每隔20 min 采集一次血浆的试验中，皮质醇浓度昼夜节律均不明显[28]。

无论犬的皮质醇浓度是否存在昼夜波动，每天犬正常活动时的皮质醇浓度波动确实会发生，如运动或其他体力消耗等，均为正常应对应激的肾上腺激素释放，可采用测量长期压力的毛发皮质醇检测方法消除1 d中皮质醇浓度自然波动的影响。

2.2 个体差异

犬类对于压力在行为和生理上的反应，在个体间差异很大。即使是同一品种的不同个体，也可能由于性别、年龄、健康、气质、过去经历等因素影响到皮质醇反应。

2.2.1 年龄差异

年龄对犬皮质醇浓度的影响不可忽视，然而关于年龄和皮质醇浓度的关系尚未得到广泛证实，仍然存在不少争议。有研究认为，小于6月龄幼犬的皮质醇浓度低于成年犬及大于8岁的老年犬[29]。Sandri等[30]的研究中统计分析了不同年龄的犬的皮质醇浓度，结果显示，老年犬的唾液中皮质醇浓度更高。Rothuizen等[31]研究结果显示，犬血液中的皮质醇浓度随着年龄呈周期性的增长。Jamie等[32]的研究显示，犬的性格随着年龄的增长会逐渐稳定，对刺激的生理和心理反应也会趋于稳定，年龄大的犬对压力可能会表现较低的皮质醇反应。但在Mongillo 等[33]的试验中却没有观察到犬的血浆皮质醇浓度在成年前和成年后存在明显的变化。因此在分析研究中应尽量避免年龄的差异给犬带来的干扰，不应将年龄差异较大的犬皮质醇浓度进行汇总或直接比较。

2.2.2 品种差异

犬的种属特异性可能会影响犬对环境刺激的反应性，不同品种个体的应激反应可能不同。同一条件下，罗威纳犬和德国牧羊犬的唾液皮质醇浓度明显高于杜宾犬和比利时牧羊犬，罗威纳犬表现出刻板行为的次数更高[34]。不同气质类型的犬对外界刺激的反映程度也存在差异，皮质醇浓度变化也存在差异，越胆小的犬可能越需要更长的时间适应新环境带来的焦虑和压力，高浓度皮质醇也可能因此持续更长的时间。由于犬之间的个体差异，建议尽可能统一其他潜在的变异来源，如年龄、性别、绝育、气质和以前的经历等因素。此外，保证足够的样本量对于弥补犬的个体差异也很必要。

2.2.3 各种测定方法的差异

各种方法测定犬皮质醇的有效性在试验中已得到验证，尽管不同方法测定的皮质醇浓度存在很强的相关性，但不同方法中的数值差别较大。同一只犬在同一条件下，粪便皮质醇浓度为（363.0±12.9） ng/g，唾液皮质醇浓度为（1.42±0.06） μg/L，毛发皮质醇浓度为（11.6±0.8） ng/g[35]。采用同一检测方法，采样、提取和储存方法及检测程序不同时，测量浓度范围也存在显著差异[36-37]。如测量毛发皮质醇浓度时，Bryan等[25]研究测得浓度为11.6 ng/g，有相似的实验结果（分别为10.9 ng/g 和9.8 ng/g），也存在差异较大的结果（2.10 ng/g）。此外，皮质醇浓度各介质的度量单位常表示为：毛发（ng/g），唾液（μg/L 或nmol/L），粪便（ng/g），血浆（nmol/L或μg/L）；单位换算关系是：1 nmol/L=0.362 47 μg/L（皮质醇分子量为362.47）。各文献中使用的皮质醇浓度单位并不统一，故有必要对皮质醇浓度统一单位，便于比较研究。

目前，皮质醇检测方法仍缺乏标准化的程序和对比试验，因此采用各种检测方法之间进行交互的方法学验证非常有必要，《免疫测定手册》可作为测定开发和验证的指南[38]。除了方法学验证外，还可采取生物学验证。生物验证有时被认为是对自然压力源的反应，有时是对肾上腺皮质活动的药理操作（如外源性促肾上腺皮质激素）的反应。在实践中可结合犬暴露在各种压力源下的反应，如噪音、新环境、运输、恶劣条件等压力源，测量犬的皮质醇浓度变化，评估压力反应与皮质醇浓度的相应性，以犬的压力反应验证皮质醇检测结果，实现皮质醇的检测用以评估和提高犬福利状态的终极目的。

3 结论

综上所述，各种测量皮质醇的检测方法各具特点，其有效性在试验中已得到验证。本文对血浆皮质醇、唾液皮质醇、粪便皮质醇和毛发皮质醇等4种犬皮质醇检测方法的优缺点以及每种检测方法的采集、提取、测定等进行综述。皮质醇检测应用于评估犬压力的研究方兴未艾，该领域需要进一步深入探索，建议犬皮质醇检测结果可采用方法学和生物学验证，采用犬的压力反应验证皮质醇检测结果，以验证皮质醇作为评价动物福利的可靠指标，更精准地评估和提高犬福利状态。