依托咪酯对小鼠小脑皮层MLI-PC突触可塑性的影响

郑景丹,金 星,万 朋,邱德来,金文哲

(延边大学附属医院1. 药剂科、2. 疼痛科,吉林 延吉 133000;3. 吉林医药学院基础医学院生理学与病理生理学教研室,吉林 吉林 132013)

依托咪酯(etomidate,ET)是一种作用强,且在临床麻醉中得到广泛应用的短效非巴比妥类静脉麻醉药,其麻醉机制与抑制多个脑区神经元活动与突触传递环路功能有关。ET抑制在体小鼠小脑浦肯野细胞放电活动,下调颗粒细胞感觉信息传递,提示ET影响小鼠小脑皮层神经环路突触传递长时程可塑性,但其影响机制尚不清楚。因此,本研究应用在体细胞贴附式技术结合神经药理学手段,研究ET对在体小鼠小脑皮层分子层中间神经元-浦肯野细胞(molecular layer interneuron-Purkinje cell,MLI-PC)突触可塑性的影响,探讨其影响的受体机制与信号通路途径,为阐明ET影响小脑皮层神经环路的突触机制提供可靠的实验基础及理论依据。

1 材料

1.1 实验动物HA/ICR小鼠32只,♀或♂,购自延边大学实验动物中心,许可证号:SYXK (Ji) 2011-006。小鼠饲养在(23±1)℃、湿度(50±5)%环境中,在12 h光照和12 h黑暗循环下,自由获取食物和水。

1.2 药物与试剂ET、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)A型受体阻断剂SR95531、大麻素1型受体(cannabinoid receptor type 1,CB1)阻断剂AM251、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)抑制剂H-89、腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)激动剂Forskolin,均购自Sigma-Aldrich公司。所有药物与试剂全部溶解在人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中,通过蠕动泵(0.5 mL·min-1)灌注于小脑表面。

1.3 仪器Picospritzer Ⅲ微量喷射器(Park,美国)、Multi-clamp700B双通道膜片钳放大器(Molecular Devices,美国)、体视显微镜及膜片钳专用显微镜(Nikon,日本)、SSC-G213数字图像系统(索尼中国广东有限公司)、MP-385电动微操纵器(Sutter,美国)、Clampex10.4数据采集与分析软件(Molecular Devices,美国)、1440AD/DA转换器(Molecular Devices,美国)。

2 方法

2.1 动物模型的制备模型制备方法依据参考文献[1-2]进行,将1.3 g·kg-1的乌拉坦腹腔注射进行麻醉,同时植入并固定好自制气管导管,之后在特制的脑立体定位仪上将小鼠妥善固定,使用两侧耳棒稳定头部,开颅手术在小脑CrusⅡ小叶以1～1.5 mm开孔直径进行,在显微镜下同时固定小鼠和脑立体定位仪,明确需要记录的部位并进行电生理记录。

2.2 细胞贴附式记录依照参考文献[2]的记录方法,小脑浦肯野细胞使用Multi-clamp700B膜片钳放大器进行细胞贴附式记录。用自动电极拉制仪将细玻璃管拉制成记录电极。通过移液枪将ACSF注入记录电极内,记录电极电阻为3～5 MΩ。缓慢刺入软脑膜下200～300 μm,径直抵达浦肯野细胞层,浦肯野细胞有规律的简单峰电位放电和不规律的复杂峰电位放电,根据其特点找到浦肯野细胞。吹风刺激(10 ms,60 psi)稳定10 min后,小脑表面灌流相关药物与试剂,记录并分析所有实验数据。

2.3 统计学分析应用Clampfit 10.4软件分析电生理学数据,所有的数据采用mean±SEM表示,同时应用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(post hoc multiple comparison)检验,检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 1 Hz的面部感觉刺激诱发小脑皮层MLI-PC长时程压抑(long-term depression,LTD)在浦肯野细胞贴附式记录模式下,吹风刺激(10 ms,60 psi)小鼠同侧触须垫,可以诱发小脑皮层CrusⅡ区的浦肯野细胞,产生一系列电位反应,表现为负极性波(N1)和正极性波(P1),并伴有简单峰电位放电活动的暂停,加入GABAA受体阻断剂SR95531(GABAzine,20 μmol·L-1)后,P1消失,反转成动作电位,表明面部吹风刺激诱发的P1为MLI-PC的GABA能突触传递。

给予1 Hz(240 pulse)的感觉刺激后,导致刺激后的P1振幅明显减小(n=8,P<0.05),并伴有简单峰电位放电暂停时间明显增加,可持续50 min以上,表明1 Hz的面部吹风刺激可以诱发MLI-PC LTD。

3.2 ET对1Hz面部吹风刺激诱导的MLI-PC突触可塑性影响在小脑表面持续灌流低浓度的ET(10 μmol·L-1)的条件下,给予1 Hz(240 pulse)的感觉刺激后,导致1 Hz的面部吹风刺激诱发的MLI-PC LTD明显增强(n=8,P<0.05),40～50 min后,P1的振幅较ACSF组明显增加(n=8,P<0.05),简单峰电位放电暂停时间明显减少。

3.3 CB1受体阻断剂存在下ET对吹风刺激诱发MLI-PC突触可塑性的影响在CB1阻断剂(AM251)存在下,给予1 Hz(240 pulse)的感觉刺激不能诱发MLI-PC LTD,40～50 min后,P1的振幅较刺激前无明显变化(n=8,P>0.05),表明1 Hz面部吹风刺激诱发的MLI-PC LTD依赖于CB1受体。在AM251和ET共同存在下,1 Hz(240 pulse)的感觉刺激依然不能诱发MLI-PC LTD,40～50 min后,P1的振幅无明显变化(n=8,P>0.05),表明在阻断CB1依赖的MLI-PC LTD后,ET的存在不能介导1 Hz面部刺激诱导产生LTD。

3.4 应用Forskolin情况下ET对吹风刺激诱发MLI-PC突触可塑性的影响应用PKA抑制剂H-89孵育30 min,给予1 Hz(240 pulse)的感觉刺激不能诱发MLI-PC LTD,40～50 min后,P1的振幅较刺激无明显变化(n=8,P>0.05),表明1 Hz面部吹风刺激诱发的MLI-PC LTD依赖于PKA信号通路。在PKA和ET共同存在下,1 Hz(240 pulse)的感觉刺激依然不能诱发MLI-PC LTD,40～50 min后,P1的振幅无明显变化(n=8,P>0.05),表明在阻断PKA依赖的MLI-PC LTD后,ET的存在不能促进1 Hz面部刺激产生LTD,提示ET增强1 Hz面部吹风刺激诱发的MLI-PC LTD通过PKA信号通路。进一步研究发现,应用腺苷酸环化酶(AC)激动剂Forskolin,可以再现1 Hz(240 pulse)的感觉刺激诱发的MLI-PC LTD及ET对该LTD的增强作用。

4 讨论

在过去几十年里,平行纤维-浦肯野细胞通路作为兴奋性突触传递及可塑性已被广泛研究,而MLI-PC抑制性突触传递与长时程可塑性的研究较少。最近的实验证据表明,MLIs对浦肯野细胞活动的控制也起着重要作用,Bing等[3]研究表明,MLI-PC突触的GABA能LTD可以被CB1受体阻断剂阻断,并可被CB1受体激动剂药理学诱导产生。阻断代谢型谷氨酸受体1不影响1 Hz面部感觉刺激诱导MLI-PC LTD,然而,拮抗N-甲基-D天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体完全阻断1Hz面部感觉刺激诱导的MLI-PC LTD,表明1Hz感觉刺激诱发的MLI-PC LTD依赖于NMDA和CB1受体。本研究结果表明,低浓度的ET可以明显增强1 Hz面部刺激诱发的MLI-PC LTD,在阻断CB1依赖的MLI-PC LTD后,ET的存在不能介导1 Hz面部刺激诱导产生LTD,表明ET强化1 Hz面部吹风刺激诱发的MLI-PC LTD也依赖于CB1受体。

Pan等[1]研究表明,即使特异性GABAA受体拮抗剂存在,ET依旧能使小脑颗粒细胞层中面部刺激引起的反应被抑制,印证小脑皮层颗粒细胞层面部刺激引发的反应被ET抑制并非完全是由GABAA受体的激活实现。在GABAA受体活性被阻断时,ET对小脑颗粒细胞层中面部刺激引起的场电位反应的抑制由PKA信号通路激活CB1受体完成。而我们前期研究发现,拮抗GABAA受体后,ET不能使小鼠小脑皮层平行纤维到浦肯野细胞的兴奋性传入增强,说明ET对小脑皮层分子层感觉信息处理的调节是通过对GABAA受体的调节实现的[2]。本研究结果显示,抑制PKA可以阻断MLI-PC LTD,并消除ET对MLI-PC LTD的作用;激动AC可以再现MLI-PC LTD及其对MLI-PC LTD的增强作用,表明ET对面部吹风刺激诱发的MLI-PC LTD依赖于PKA信号通路实现。

综上所述,1 Hz的面部吹风刺激可诱发MLI-PC LTD,而ET对MLI-PC LTD有明显强化作用,其作用依赖于CB1受体和PKA信号通路,提示低浓度ET影响MLI-PC可塑性的诱导和维持过程。