苦参碱对肺结核大鼠结核杆菌及Ire1信号的作用及机制

王超 赵鹏 张竞美

(青岛市胸科医院，山东 青岛 266043)

肺结核是由结核分枝杆菌引发的肺部感染性疾病，临床表现为盗汗、发热、月经失调、呼吸困难等症状，严重威胁人类的健康〔1〕。结核分枝杆菌简称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，其中肺结核最为多见〔2〕。肺结核至今仍为重要的传染病，有报道显示，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病〔3〕。我国结核病患病人数高居世界第2位，肺结核处于高发状态，因此肺结核疾病仍是临床上治疗的难题。苦参为豆科愧属植物苦参的干燥根，是中国历史悠久的传统药物之一〔4〕。苦参属于清热燥湿药，其性味苦寒，有清热燥湿和利尿的功效〔5,6〕。近些年，国内外对苦参的研究重点放在生物碱上，目前已经从苦参中分离出27种生物碱。苦参生物碱大多属于喹诺里西啶类，极少数为双哌啶类，以苦参生物碱和氧化苦参碱含量最高，并且苦参碱具有肝细胞保护、消炎镇痛、抑菌抗病毒等多方面的药理活性〔7,8〕。苦参素胶囊在肺结核治疗中具有良好的保肝作用，因此苦参碱可以制成适宜剂型以便于临床上更好地治疗肺结核〔9〕。肌醇必需酶(IRE)1是存在于内质网膜上的跨膜蛋白，哺乳动物中存在IRE1α和IRE1β两种亚型，IRE1α在哺乳动物所有的组织细胞中普遍存在，而IRE1β则存在于呼吸道、胃肠道消化系统的上皮细胞中〔10〕。IRE1α在不同的组织细胞中表达也大不相同，目前还没有明确报道证实IRE1α在肺结核肺组织中的表达情况，因此本文建立肺结核大鼠模型，并给予苦参碱治疗干预，观察苦参碱对肺结核大鼠结核杆菌的抑制作用及其对IRE1信号的表达的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物 大鼠均来中国科学院上海实验动物中心，共计60只健康大鼠，体重平均(221.5±1.4)g，正常饲养，保证实验室清洁，昼夜交换更替，保持实验室温度在24℃。

1.2试剂和仪器 苦参碱(上海第二军医大学药学院中西药研究室)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒、一抗二抗去除液(强碱性)、细胞裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒、IRE1抗体均购自沈阳万科生物科技有限公司；低温高速离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)；成像系统(Bio-Rad公司)；多功能电泳仪购自北京鸿涛基业科技发展有限责任公司。

1.3动物分组与模型建立 大鼠随机分为正常组、PTB组和Mat组，每组20只。正常组大鼠尾静脉注射0.2 ml 0.9%氯化钠注射液。PTB组和Mat组大鼠尾静脉注射由结核患者痰液中分离的结核分枝杆菌，该杆菌已按结核病诊断细菌学检验规程验证为结核分枝杆菌，取分裂旺盛的模型菌，用 0.9%氯化钠溶液溶解，每只大鼠注射0.2 ml细菌悬液。

造模成功后，正常组和PTB组大鼠给予等量的生理盐水灌胃干预；Mat组大鼠给予苦参碱灌胃，每千克大鼠给予30 mg进行干预，3组大鼠给药干预1次/d，连续干预30 d。

1.4标本采集 检测各组大鼠给药后第1天、15天和30天体重变化。造模30 d时，用颈部脱臼法分别处死3组大鼠，留取肺组织，放置在-80℃的冰箱中保存，以用于后续实验。

1.5测定大鼠体重 在给药后1 d、15 d和30 d时，分别对正常组、PTB组和Mat组大鼠的体重进行测量并比较。

1.6大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落计数 取每只大鼠全部左肺组织，加入2 ml 0.9%氯化钠注射液后研磨成匀浆，再取组织液加等体积4%硫酸消化15 min 后，加入2.5 mol NaOH调整至pH7.0左右，接种于斜面培养基，置于37℃下培养5 w，计数培养基上结核分枝杆菌菌落数。

1.7肺组织病理学形态观察 分别取出正常组、PTB组和Mat组大鼠的肺组织取出，固定后用石蜡进行包埋处理，把包埋后的组织进行切片，每个切片组织均为5 μm，切片组织脱蜡后，用苏木素-伊红(HE)染色观察。用显微镜对染色的肺组织进行观察，观察组织形态的变化。

1.8Western印迹法检测肺组织中Ire1α和GRP78蛋白的表达 3组大鼠的肺组织分别提取100 mg，细胞进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在-20℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，按照4∶1的比例进行，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。电泳板孔内注入蛋白样品，50 μg。转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后加脱脂奶粉，封闭1 h。TTBS洗涤要在加入的1抗前进行，每次漂洗10 min，一共进行3次漂洗，最后加入2抗对溶液进行稀释，再在常温的环境中封闭1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，二氨基联苯胺(DAB)显色后数码相机照相。

1.9qRT-PCR法检测肺组织中IRE1α和GRP78 mRNA的表达 分别取出3组大鼠的肺组织，用Trizol将组织进行裂解，对总的DNA进行提取，所有的逆转录反应按照说明书进行，经所得到的cDNA进行荧光实验。反应按照反应条件严格进行扩增，变性30 s 95℃，变性5 s 95℃，退火40 s 60℃，一共45个循环。取平均值后得到Ct值，计算方法用2-△△Ct法进行分析，引物序列见表1。

表1 引物序列表

1.10统计学分析 采用SPSS19.0统计学软件进行t检验、单组间因素分析。

2 结 果

2.13组大鼠体重比较 给药后1 d 3组大鼠的体重变化没有显著差异(P>0.05)。给药后15 d和30 d，与正常组体重相比，PTB、Mat组体重显著降低(P<0.05)；给药后15、30 d，Mat组体重明显高于PTB组(P<0.05)，见表2。

2.23组肺组织结核分枝杆菌菌落计数比较 正常组肺组织中没有结核分枝杆菌的菌落出现，和正常组大鼠相比，PTB组大鼠的肺组织中结核分枝杆菌的菌落数量显著增多(P<0.05)；Mat组肺组织中结核杆菌的菌落数量显著低于PTB组(P<0.05)，见表3。

2.3肺组织病理变化比较 正常组肺组织没有出现明显的病理变化。与正常组相比较，PTB组大鼠肺脏血管周围有大量的炎性细胞浸出，并且出现了大量的肉芽肿样细胞聚集；肺间质之间出现了大量的水肿，大体解剖可见肺脏表面存在白色栗粒状结节。Mat组肺组织病理情况明显好于PTB组，见图1。

表2 3组给药后1 d、15 d和30 d体重比较

表3 3组肺组织结核分枝杆菌菌落计数及IRE1α、 GRP78蛋白表达比较

图1 3组肺组织(HE染色，×100)

2.43组肺组织中IRE1α和GRP78蛋白表达比较 与正常组相比，PTB组肺组织中IRE1α和GRP78蛋白表达显著增多(P<0.05)；Mat组肺组织中IRE1α和GRP78蛋白表达明显低于PTB组(P<0.05)，见表3、图2。

图2 3组肺组织中IRE1α和GRP78蛋白表达

2.53组肺组织中IRE1α 和GRP78 mRNA表达比较 与正常组相比较，PTB组肺组织中IRE1α和GRP78 mRNA表达增多，差异有统计学意义(P<0.05)；Mat组肺组织中的IRE1α和GRP78 mRNA表达低于PTB组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 3组肺组织中IRE1α、GRP78 mRNA 表达比较

3 讨 论

肺结核属于慢性呼吸传染疾病，主要由结核分枝杆菌感染肺部导致机体免疫应答紊乱引起，患者可通过呼吸及咳嗽产生飞沫或痰液传播，影响社会健康〔11〕。肺结核病程长，病理变化复杂，临床表现为机体细胞因子分泌失衡、肿瘤坏死因子释放过多等症状，导致患者呼吸系统功能异常〔12〕，严重者会导致肺部空洞，故疾病早期予以良好治疗意义重大。苦参碱是从中药苦豆子中分离出来的单体生物碱，具有提高免疫力、抗病毒、抗炎、抗肿瘤等方面的药性活性和临床用途〔13〕。有研究结果证实，苦参碱在结核杆菌标准珠H37RV浓度为104CFV/ml时，MIC值为10 mg/L，和传统的方法相比效果更为显著，由此说明苦参碱有抑制结核杆菌生长的作用〔14〕。IRE1α具有复杂的结构和功能，是目前报道的蛋白中唯一一个同时具有激酶和核酸内切酶活性的蛋白〔15〕。有研究发现，IRE1α能通过多种途径诱导细胞凋亡和参与炎症反应，并且介导着代谢性疾病的发生发展〔16〕，但目前还没有实验证明IRE1α在肺结核中具体表达，因此本文给予肺结核大鼠苦参碱进行干预治疗，证实其对肺结核结核杆菌的抑制作用，并观察苦参碱对肺结核大鼠肺组织中IRE1α蛋白表达的影响。

本文建立肺结核大鼠模型，实验结果显示经过苦参碱治疗后大鼠的体重明显回升，并且大鼠状态也得到了改善，可见苦参碱可有效改善肺结核大鼠的症状。结核分枝杆菌菌落计数可直接反映肺结核病的严重程度，本研究结果说明，苦参碱治疗以后，患病大鼠的病症明显减轻，结核治疗效果明显。苦参碱有降低DNA含量的功能，这可能是其抑制结核杆菌生长的作用之一。吴涛等〔17〕研究发现检测苦参碱药物高低浓度时，有70%在抑菌浓度范围内，还有23%为高低浓度生长菌，可能是结核杆菌的耐药株，其对大多数抗生素有一定抵抗能力，还有2株为高低浓度敏感株，可能比较脆弱的结核杆菌株存在。连续培养30 d后发现高低浓度的生长菌比例明显上升，说明苦参碱有显著的抑菌作用，虽然不能杀死全部的结核杆菌，但能有效减缓细菌的生长速度。

在治疗抗结核的药物中均有不同程度的肝细胞毒性，治疗结合病中经常伴随着肝细胞的损伤，而肝细胞的损伤往往伴随着细胞的过度凋亡、而细胞凋亡最主要的途径就是内质网应激，有研究表明，内质网应激是肺结核发生发展的重要病理机制。IRE1信号通路是内质网应激信号通路中的经典通路，被认为与慢性疾病引起的细胞凋亡有关〔18〕。当内质网应激发生时，葡萄糖调节蛋白(GRP)78的解离促进了IRE1α的激活，驱动多种未折叠的蛋白应答相关的基因表达，从而诱发细胞凋亡〔19〕。GRP78又称为免疫球蛋白重链结合蛋白，当内质网应激时对受到刺激的细胞最先进行保护，被称为内质网应激途径的关键标志性因子。本研究结果提示，苦参碱能有效抑制肺结核肺组织中IRE1α和GRP78的表达。有研究者把肺结核患者随机分为治疗组和对照组，治疗组患者给予苦参素胶囊干预，结果显示治疗组患者均未出现肝功能损伤，而对照组有1/3患者肝功能受到严重损伤〔20〕，说明苦参素胶囊在肺结核化疗中同时具有较高的保肝效果，因此苦参碱可以制成适宜剂型以便于临床上更好的治疗肺结核。王捷等〔21〕通过对肺动脉损伤的大鼠研究证实，在模型组大鼠肺组织中IRE1信号通路中关键因子IRE1α和GRP78均显著升高，药物治疗后发现其表达得到了显著的抑制，进而降低肺动脉的压力，为肺动脉损伤的靶向治疗提供新的途径。

综上，苦参碱可有效抑制肺结核结核杆菌的生长，同时对肺组织中IRE1α信号通路进行抑制，进而对肺组织进行保护。