藏红花水提取物通过调控ERK、Bcl-2、Bax蛋白表达影响人卵巢癌细胞HO-8910增殖①

边庆华 彭皇青 周月娟 印志进 （南昌市洪都中医院，南昌 330000）

卵巢癌早期症状不明显，患者确诊时往往处于中晚期，且此时治疗方式主要为化疗，虽能一定程度提高患者五年生存率，但也存在显著毒副作用，所以近年来，研究人员将关注重点放在了中草药上［1-3］。研究发现，藏红花中的藏红花素、藏红花苦素等均有明显抗癌作用，能够抗白血病、卵巢癌、结肠癌等多种癌症［4-6］。现有的研究发现，藏红花素可以用于多种癌症的治疗，且临床效果较好［7-8］。细胞外调节蛋白激酶（ERK）是细胞外信号调节激酶，参与细胞的增殖、分化、凋亡等过程，ERK信号通路持续活跃参与多种肿瘤的发生和发展［9］。所以本研究旨在观察藏红花水提取物对人卵巢癌细胞HO-8910增殖、凋亡、侵袭的影响，并初步探索其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人卵巢癌HO-8910细胞购自北京 BNCC。

1.1.2 试剂、仪器 大鼠抗小鼠ERK、Bax、Bcl-2抗体（无锡云萃生物科技公司）；DMEM培养基（深圳市百恩维生物科技公司）；胎牛血清（北京沃卡威生物技术有限公司）；MTT试剂盒（上海泽叶生物科技公司）；胰酶（江苏采薇生物科技公司）；多功能酶标仪（HBS-1101，北京华泰和合商贸有限公司）；CO2培养箱（GC-300TL，上海沉汇仪器公司）；生物洁净工作台（BBS-H1100，济南鑫贝西生物科技公司）；显微镜（CX33，山东高芯生物传感器公司）；离心机（TG16G，盐城凯特实验仪器公司）；紫外可见分光光度计L9，上海仪电分析）；数显恒温水浴锅（SHJ-6A,常州金坛良友仪器公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取藏红花水提取物 取75 g蒸馏水加热至100 ℃，加入1.5 g藏红花中，浸泡120 min，收集上清液；再加入75 g 100 ℃的蒸馏水，浸泡120 min，收集上清，将两次收集的上清混合均匀后加热，将浓度调整至187 g/L。pH值因素对藏红花水提取物稳定性的影响较大，强酸和强碱环境对其破坏性均较高，其初始pH值为6.2左右，在pH值为6的环境下较为稳定，所以本实验将藏红花水提取物的pH值稳定在6时进行。实验也是在各分组渗透压稳定的情况下进行。

1.2.2 HO-8910细胞培养 取对数生长期细胞，细胞培养使用含10%FBS、100 U/ml 青霉素、0.1 mg/ml链霉素的DMEM细胞培养液，培养条件为37 ℃、5%CO2，细胞传代用0.25%胰蛋白酶。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖 将稳定传代的HO-8910细胞消化，调整细胞悬液浓度为5×104个/L，接种于96孔板内，在每板每孔内加入200 μl培养液。每个浓度设置6个复孔，分别加入藏红花水提取物0 mg/L（对照组）、0.4 mg/L（低剂量组）、0.8 mg/L（中剂量组）、1.0 mg/L（高剂量组），作用24 h后，每孔加入5 mg/ml 200 μl MTT，静置培养4 h后取出，1 000 r/min离心10 min，再将孔内培养液小心吸

去，每孔内加入200 μl DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪OD 490 nm处检测各孔吸光值（A）。计算各孔细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。实验重复3次，取平均值。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率 将培养好的HO-8910细胞根据藏红花提取物浓度标记对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，在标准条件下培养，收集细胞悬液，控制恒温4 ℃，此条件下添加适量PI染液和Annexin Ⅴ试剂，避光孵育20 min后，使用流式缓冲液洗涤后，检测凋亡率。

1.2.5 划痕实验 收集HO-8910细胞并计数，接种于24孔板，浓度1×104个/孔。80%融合时，用塑料移液器枪头比着直尺垂直沿同一方向刮伤，用PBS洗涤细胞3次，在37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养36 h后，在显微镜下拍摄结果照片，观察伤口愈合情况。

1.2.6 细胞侵袭能力试验 DMEM培养基配置基质胶，加入24孔Transwell小室。分别使用0、0.4、0.8、1.0 mg/L浓度藏红花水提取物作用于人卵巢癌HO-8910细胞16 h，Transwell检测细胞侵袭能力，显微镜下观察细胞侵袭情况。

1.2.7 蛋白表达检测 提取总蛋白，与上样缓冲液按比例混合，煮沸5 min后，电泳，转至PVDF膜，封闭1～2 h，加一抗溶液TBST（ERK、Bcl-2、Bax按照1∶1 000稀释），4 ℃振荡过夜，洗涤，加二抗溶液TBST（ERK、Bcl-2、Bax按照1∶5 000稀释），室内振荡120 min，洗涤，显色成像。

1.3 统计学分析 实验数据以±s记录，统计分析用SPSS23.0软件进行，多组间比较采用F检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HO-8910的增殖活力 人卵巢癌细胞HO-8910的增殖活力受到藏红花水提取物的影响，随藏红花水提取物剂量增加，人卵巢癌细胞HO-8910的增殖活力减弱，见表1。

表1 HO-8910的增殖活力（±s，n=6）Tab.1 Proliferation activity of HO-8910 （±s，n=6）

表1 HO-8910的增殖活力（±s，n=6）Tab.1 Proliferation activity of HO-8910 （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with the medium-dose group， 3）P＜0.05.

Proliferation activity/%69.85±6.98 44.56±4.591）36.38±2.691）2）22.89±0.381）2）3）121.363＜0.001 Groups Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P

2.2 HO-8910的凋亡率 人卵巢癌细胞HO-8910的凋亡率受到藏红花水提取物影响，随藏红花水提取物剂量增加，人卵巢癌细胞HO-8910的凋亡率增加，见表2、图1。

图1 HO-8910的凋亡情况Fig.1 Apoptosis of HO-8910

表2 HO-8910的凋亡率（±s，n=6）Tab.2 Apoptosis rate of HO-8910（±s，n=6）

表2 HO-8910的凋亡率（±s，n=6）Tab.2 Apoptosis rate of HO-8910（±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with medium dose group， 3）P＜0.05.

Apoptosis rate（%）8.69±0.81 12.94±0.961）24.28±1.031）2）35.62±1.111）2）3）911.453＜0.001 Groups Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P

2.3 HO-8910的迁移情况 人卵巢癌细胞HO-8910的划痕闭合率受到藏红花水提取物影响，随藏红花水提取物剂量增加，人卵巢癌细胞HO-8910的划痕闭合率下降，见表3、图2。

图2 HO-8910的迁移情况Fig.2 Migration of HO-8910

表3 HO-8910的迁移情况（±s，n=6）Tab.3 Migration status of HO-8910 （±s，n=6）

表3 HO-8910的迁移情况（±s，n=6）Tab.3 Migration status of HO-8910 （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with medium dose group， 3）P＜0.05.

Scratch closure rate/%99.69±0.21 75.25±6.961）50.28±4.031）2）33.69±2.031）2）3）291.026＜0.001 Groups Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P

2.4 HO-8910的侵袭情况 人卵巢癌细胞HO-8910的侵袭细胞数受到藏红花水提取物影响，随藏红花水提取物剂量增加，人卵巢癌细胞HO-8910的侵袭细胞数减少，见表4、图3。

图3 HO-8910的侵袭情况Fig.3 Invasion of HO-8910

表4 HO-8910的侵袭情况（±s，n=6）Tab.4 Ho-8910 invasion status （±s，n=6）

表4 HO-8910的侵袭情况（±s，n=6）Tab.4 Ho-8910 invasion status （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with medium dose group， 3）P＜0.05.

Number of invaded cells/%43.69±2.81 36.25±1.961）19.28±1.011）2）13.69±0.891）2）3）351.298＜0.001 Groups Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P

2.5 HO-8910的ERK、Bcl-2、Bax蛋白表达 ERK、Bcl-2蛋白的表达降低，Bax蛋白的表达增加，且藏红花水提取物剂量越高，ERK、Bcl-2蛋白表达越低，Bax蛋白表达越高，见表5、图4。

图4 ERK、Bcl-2、Bax蛋白表达Fig.4 Protein expression of ERK， Bcl-2 and Bax

表5 HO-8910的ERK、Bcl-2、Bax蛋白表达（±s，n=6）Tab.5 Expression of ERK， Bcl-2 and Bax proteins in HO-8910 （±s，n=6）

表5 HO-8910的ERK、Bcl-2、Bax蛋白表达（±s，n=6）Tab.5 Expression of ERK， Bcl-2 and Bax proteins in HO-8910 （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with low dose group， 2）P＜0.05； compared with medium dose group， 3）P＜0.05.

Groups ERK Bcl-2 Bax 0.58±0.02 0.67±0.011）0.79±0.031）2）0.90±0.041）2）3）146.452 ＜0.001 Control Low dose Middle dose High dose Saffron extract concentration/（mg·L-1）0 0.4 0.8 1.0 F P 1.25±0.11 0.93±0.091）0.65±0.041）2）0.48±0.021）2）3）122.180＜0.001 0.79±0.06 0.61±0.041）0.49±0.021）2）0.31±0.011）2）3）192.591＜0.001

3 讨论

近年来，卵巢癌的发病率和死亡率呈上升趋势，且卵巢位于盆腔内，位置隐蔽，发病早期无特异性表现，缺少早期特异性诊断标志物，较难诊断［10-11］。目前，卵巢癌的治疗以手术切除、放化疗为主，近年来，研究人员不断探索新的治疗方式，在此过程中，中药凭借其靶点众多，治疗效果明显，毒副作用小等优点脱颖而出，得到众多学者的关注。藏红花是我国名贵的中药材，有“植物黄金”的称号［12-13］。藏红花提取液是羟自由基与超氧自由基的强效清除剂，能够明显改善线粒体，抑制视网膜的凋亡，还具有提高免疫力、抗动脉硬化、抗氧化、保护肾脏等作用［14］。相关研究证实，藏红花提取物具有光谱的抗肿瘤活性、对白血病、结肠癌等恶性肿瘤具有较强的抑制作用，对正常细胞影响较小，能够与其他抗癌药物联合使用，减少抗癌物质的毒副作用［15］。因此在本研究中，使用藏红花水提取物研究其对人卵巢癌细胞HO-8910增殖、凋亡、侵袭的影响，以寻找其作用机制，为临床上卵巢癌细胞的研究提供新的方向。

本研究观察HO-8910细胞增殖活力发现，人卵巢癌细胞HO-8910的增殖活力随藏红花水提取物的剂量而改变，藏红花水提取物的剂量越高，其对人卵巢癌细胞HO-8910的增殖抑制作用就越强，关于藏红花抑制癌细胞增殖活力这一观点，在李萍等［16］关于藏红花素与宫颈癌的研究中也有提到。流式术表明，人卵巢癌细胞HO-8910的凋亡与藏红花水提取物密切相关，藏红花水提取物的剂量越高，人卵巢癌细胞HO-8910的凋亡率就越高，许存庚等［17］在文章中指出，藏红花素联合顺铂可抑制胃癌细胞BGC-823的增殖，促进其凋亡，文中提到其作用机制可能与抑制ERK信号通路相关。细胞划痕法证明，人卵巢癌细胞HO-8910的划痕闭合率受到藏红花水提取物影响，藏红花水提取物的剂量越高，人卵巢癌细胞HO-8910的划痕闭合率越低，这指示藏红花水提取物可以有效抑制卵巢癌细胞的迁移，并且藏红花水提取物的剂量越高，其对癌细胞迁移的抑制作用越明显。董盛宇等［18］在关于藏红花素与人鼻咽癌细胞的研究中也证实，藏红花素能够有效抑制人鼻咽癌细胞株的迁移能力。另外，在本研究中采用Transwell法检测藏红花水提取物对人卵巢癌细胞HO-8910侵袭能力的影响，结果表明，藏红花水提取物能苟有效抑制人卵巢癌细胞HO-8910的侵袭，并且其剂量越高，对癌细胞侵袭能力的抑制作用越明显，李婷等［19］研究结果表明，hepaCAM过表达腺病毒联合藏红花素可显著抑制PC3细胞的侵袭转移，作用机制或与EMT和 MMPs的表达有关。

文献记载，藏红花水提取物可以缓解使用顺铂、环磷酰胺等抗癌药物后出现的毒副作用，由此推测，藏红花提取物与其他抗癌药联合使用或许可减轻抗癌药物带来的毒副作用［20］。ERK处于细胞质信号转导通路的末端位置，其能激活磷酸化，进入到细胞核中，与AP-1、NF-κB等因子相结合，促进基因转录与表达。刘丽冰等［21］研究指出，CART肽提高OGD处理后星形胶质细胞的活力，并通过激活ERK通路抑制OGD处理后细胞AQP-4的表达。Bcl-2、Bax是检测凋亡的重要蛋白［22］。本实验结果表明，随藏红花水提取物剂量升高，ERK蛋白表达量逐渐降低，这提示我们藏红花水提取物可以抑制ERK的活性，由此推测藏红花水提取物抑制肿瘤细胞生长可能与抑制ERK通路有关，且本研究还发现Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，表明藏红花水提取物能够提高凋亡蛋白的表达促进细胞凋亡，这一点在徐婧等［23］、夏丹等［24］的文章中也有证实。

综上所述，藏红花水提取物抑制卵巢癌细胞的增殖活力、迁移能力及侵袭能力，并诱导卵巢癌细胞凋亡，这可能是通过调控ERK、Bcl-2、Bax蛋白表达来实现的。