固相萃取结合LC/MS-MS法测定奶粉中四溴双酚A

2023-03-03綦艳李锦清李聪黄翠莉

食品工业 2023年2期

綦艳，李锦清，李聪，黄翠莉

广东产品质量监督检验研究院（顺德 528300）

四溴双酚A（tetrabromobisphenol A，TBBPA）是一种常见的溴类阻燃剂，被广泛应用于塑料、橡胶、纺织品、电子电气等工业产品中。工业产品释放的TBBPA容易通过水体、土壤等途径进入环境中[1]，通过迁移、扩散污染食物。据报道，环境样品[2]、动物源性食品[3]、人体内[4]均检出TBBPA。TBBPA具有生物蓄积性和持久性，可能会危害人类健康，据研究报道[5-6]，TBBPA能干扰人体甲状腺激素分泌，欧盟将其列为优先控制化学品之一，并开展危险性评估[7]。

关于TBBPA的研究主要集中在环境水体[8-9]、土壤[10-12]、塑料包装材料[13]、电气产品[14]、食品[15-18]等方面，检测方法有气相色谱-质谱联用法、液相色谱-串联质谱法[19]、液相色谱法等。TBBPA极性较强[20]，在毛细管色谱柱中保留时间很短，GC-MS法测定前需衍生化，步骤繁琐。液相色谱法灵敏度较低，不适合痕量TBBPA检测。LC-MS/MS法无需衍生化，灵敏度高、结果准确，成为TBBPA检测的主要手段。

牛奶经加工制成奶粉后，可能存在的TBBPA被浓缩富集，危害性增大。奶粉中TBBPA检测的标准或文献尚未见诸报道。食品中TBBPA的检测标准仅有DBS 42/004—2014《食品安全地方标准动物性食品中六溴环十二烷和四溴双酚A的测定》，其前处理方法采用索氏提取和自制硅胶柱净化，步骤繁琐、耗时长、有机溶剂消耗较大。试验旨在建立固相萃取结合LCMS/MS法测定奶粉中TBBPA的分析方法，具有操作简单、有机溶剂消耗少，回收率高、准确可靠等优点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；乙酸铵（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲醇、乙酸乙酯（色谱纯，美国Tedia公司）；氢氧化钠（分析纯，广州化学试剂厂）；水（符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》要求的一级水）；C18固相萃取柱（未封尾，规格1 g/12 mL，月旭科技有限公司）；PTFE-Q针式滤头（规格0.22 μm/13 mm，美国Agilent公司）；四溴双酚A标准品（纯度≥99.4%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）；四溴双酚A-D4（TBBPA-D4，纯度≥98%，加拿大C/D/N ISOTopes公司）。

奶粉样品（包括婴幼儿配方奶粉1段15批次，2段10批次，3段10批次，中老年奶粉10批次；市售，随机购买）。

1.2 仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪（Exion LC AD/SCIEX Triple Quad 4500，美国AB SCIEX公司）；艾本德高速冷冻离心机（5804R，德国eppendorf公司）；多位涡旋振荡器（MV-3000，广东晋元科技有限公司）；全自动智能氮吹仪（FV64，广州得泰仪器科技有限公司）；去离子水发生器（Milli-Q，美国Millipore公司）；电子天平（JJ500Y，精度0.01 g，福州华志科学仪器有限公司）；电子天平[MS105DU，精度0.1 mg，梅特勒托利多科技（中国）有限公司]；超声波清洗机（JPC300，广州市吉普超声波电子设备有限公司）；pH计（雷磁PHS-3C，精度0.01，上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的制备

精密称取四溴双酚A、四溴双酚A-D4各10 mg（精确至0.1 mg）分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配得质量浓度均为100 mg/L的四溴双酚A、四溴双酚A-D4标准品储备液，于-20 ℃保存。精密吸取0.1 mL四溴双酚A、四溴双酚A-D4标准品储备液，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配得质量浓度均为1 mg/L标准品中间液。精密吸取1 mL四溴双酚A、四溴双酚A-D4标准品中间液，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释，配得质量浓度均为0.1 mg/L标准品使用液。

精密吸取适量四溴双酚A标准品中间液或标准品使用液及四溴双酚A-D4标准品使用液，用空白奶粉基质提取液稀释，配成四溴双酚A-D4质量浓度均为5 μg/L及质量浓度范围为0.2～150 μg/L的四溴双酚A标准工作曲线，用LC-MS/MS测定，以基质匹配-同位数内标标准工作曲线法定量。

1.3.2 样品前处理

1.3.2.1 提取

称取2 g（精确至0.01 g）奶粉样品，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入50 μL四溴双酚A-D4标准品使用液，加入10 mL水和200 μL 5%氢氧化钠溶液，按2 300 r/min涡旋3 min，加入9 mL乙腈，摇匀后超声提取30 min，按9 000 r/min离心3 min，取液体转移至另一个50 mL聚丙烯塑料离心管中，样品再用3 mL乙腈重复提取1次，合并液体于50 mL聚丙烯塑料离心管中，用水稀释至离心管50 mL刻度，用磷酸调节提取液pH＜5，摇匀，制得待净化液，待净化。

1.3.2.2 净化

C18固相萃取柱依次用12 mL甲醇、15 mL水活化。将1.3.2.1制得的待净化液分次转移至C18固相萃取柱中，弃去全部流出液，分别用12 mL 5%甲醇水（V/V）溶液和12 mL水淋洗C18固相萃取柱，弃去淋洗液，负压抽干5 min。用10 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，45 ℃水浴条件下用氮气吹干，用1.0 mL 70%甲醇-水溶液复溶，过0.22 μm有机系滤膜，LC-MS/MS检测。

1.3.3 液相色谱条件

色谱柱Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为甲醇；流动相B为水；柱温25 ℃；进样量10 μL。梯度洗脱程序：0～2.0 min，55% B；2.0～2.1 min，55%～20% B；2.1～8.0 min，20% B；8.0～8.1 min，20%～10% B；8.1～12.0 min，10% B；12.0～12.1 min，10%～55% B；13.0～14.0 min，55% B。

1.3.4 质谱条件

电喷雾负离子模式（ESI-）；数据采集：多反应监测（MRM）模式；电喷雾电压-4 500 V；脱溶剂温度550 ℃；气帘气压力25 psi；雾化气压力50 psi；干燥气压力50 psi；碰撞气压力9 psi。化合物保留时间、离子对、锥孔电压、碰撞能量、驻留时间等见表1。

表1 四溴双酚A和四溴双酚A-D4质谱参数

2 结果与分析

2.1 样品提取

四溴双酚A微溶于水，易溶于乙腈，且乙腈沉淀蛋白效果较好，因此选择乙腈作为提取试剂和蛋白沉淀剂。奶粉呈颗粒状，乙腈难以渗透至奶粉颗粒内部，不能有效提取待测化合物。因此，用水将奶粉样品溶解并形成分散性较好的奶液，加入氢氧化钠溶液使奶液中四溴双酚A充分转化为易溶于水的四溴双酚A钠盐游离至水中，使获得较高的萃取率。

试验比较分别加入2，3，4，5和6倍于奶粉质量（2 g）的水体积（单位为mL）溶解奶粉对提取回收率影响。结果表明：当加入水体积2～4倍于奶粉质量时，形成的奶液较黏稠，乙腈与奶液混合不充分；加入水体积5～6倍于奶粉质量时，形成的奶液分散性较好，黏稠度低，乙腈与奶液可充分混合，有利于提取。因此，选择5倍于奶粉质量的水体积（10 mL）溶解奶粉。

5%氢氧化钠溶液加入量200 μL左右较合适，此时奶液pH呈碱性，既可使分子态的四溴双酚A转化为易溶于水的四溴双酚A钠盐，同时去除奶粉中脂肪，避免加入过多氢氧化钠溶液导致分解出更多干扰杂质。样品首次提取乙腈用量为9 mL，蛋白质可完全沉淀，获得澄清提取液，重复提取时乙腈用量仅需3 mL，与常用的索氏提取法或加速溶剂萃取法相比，具有有机试剂用量少、回收率高、批量样品检测效率高等优点。

2.2 样品净化

四溴双酚A含有2个酚羟基，其水溶性随pH变化[21]，2个酚羟基的pKa值分别为7.5和8.5[22]，在pH＜5条件下，基本上以未离解的分子形式存在；在中性pH条件下，离子态和分子态共存；碱性条件下，以易溶于水的离子形式存在。利用四溴双酚A的这些特点，用碱性水溶液溶解奶粉样品，可将各种形态存在的四溴双酚A转化为易溶于水的离子态，提高溶出率，从而提高回收率。试验比较发现，提取液pH为中性或碱性时，C18固相萃取回收率较低，但提取液调节为pH＜5后，回收率显著提高。因此，选择采用碱性水溶液提取，pH＜5条件下C18固相萃取柱净化。

进一步比较C18固相萃取柱填料封尾与未封尾对回收率的影响。结果表明，填料未封尾的C18固相萃取柱的绝对回收率比封尾的高约30%，原因可能是未封尾的填料表面较多的硅醇官能团为四溴双酚A提供额外的极性相互作用，与封尾的相比，增强对四溴双酚A的保留，因此回收率更高。试验比较发现，待净化液中乙腈比例超过25%时，C18固相萃取回收率较低，因此，用水稀释使待净化液中乙腈比例不超过25%，用磷酸调节提取液pH＜5，确保具有较高回收率。

四溴双酚A易溶于甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有机试剂[23]，这些试剂均可作为C18固相萃取的洗脱液，但洗脱效果差异较大。试验比较发现，乙酸乙酯洗脱时回收率最高，且回收率较稳定，仅需10 mL乙酸乙酯洗脱，回收率达90%以上，因此选择乙酸乙酯作为洗脱试剂。

2.3 基质效应

基质效应是液相色谱-串联质谱法检测过程中普遍存在的现象[24-26]，对检测结果的准确度有很大影响，因此开展基质效应评估十分必要。除不加同位素内标外，按照优化方法对添加四溴双酚A 3 μg/kg的奶粉样品进行3平行测定，分别用70%甲醇-水溶液、空白样品基质提取液配制的标准工作曲线进行外标法定量，计算平均回收率，考察基质效应。结果表明，以70%甲醇-水溶液配制的标准工作曲线定量的平均回收率为35%；以空白基质提取液配制的标准工作曲线定量（即基质匹配外标法定量）的回收率为67%；表明存在较强的基质抑制作用。在食品检测中消除或减少液相色谱-串联质谱法基质抑制的常用的方法有基质匹配法[27-28]、同位素内标法[29-30]等，试验采用空白基质提取液与同位素内标相结合（即基质匹配-同位素内标法）配制标准工作曲线进行定量，平均回收率为90%，有效降低基质抑制作用，使定量结果更加准确、可靠。

2.4 线性范围、检出限和定量限

在优化条件下，对基质匹配-同位素内标标准工作曲线进行测定，结果表明，四溴双酚A在0.2～150 μg/L范围内，线性方程为y=0.172 92x-0.029 62，相关系数为r≥0.995，呈良好线性关系。采用空白奶粉样品添加四溴双酚A标准品的方式考察方法检出限和定量限，以定量离子信噪比（signal-to-noise ratio，rSN）不低于3时，作为方法检出限（SLOD），方法检出限为0.5 μg/kg；以定量离子信噪比（Signal-to-noise ratio，rSN）不低于10时，作为方法定量限（SLOQ），定量限为1.5 μg/kg。

2.5 加标回收率及精密度

向空白奶粉样品中添加3个水平浓度标准品，每个水平平行测定6次。四溴双酚A标准品的添加水平为1.5，3.0和15.0 μg/kg，每个浓度水平平行测定6次，平均回收率及相对标准偏差（SRSD）见表2。结果显示，平均加标回收率为92.3%～100.2%，相对标准偏差（SRSD）为6.8%～8.3%，具有较好的回收率和精密度，满足奶粉中四溴双酚A的分析要求。图1为基质匹配-同位素内标标准溶液中四溴双酚A及四溴双酚A-D4的提取离子色谱图，图2为空白奶粉样品添加四溴双酚A（5 μg/kg）的提取离子色谱图。