一株产蓝色素微生物的筛选鉴定及色素性质分析

衡好，王尧，程佳怡，刘行准，杨怡，郭静静

南京师范大学中北学院环境生物技术研究中心（丹阳 212300）

色素具有极高的应用价值，在医药、化妆品、科研染料、轻纺印染及食品等领域中均具有广泛的应用前景。天然色素是以植物、动物及微生物等为原料，采用合适的方法可提取生物体内细胞产生的色素。植物体的生长受气候、温度等外界条件的限制较大。动物体繁殖周期长、细胞培养条件相对苛刻，与二者相比，微生物具有种类繁多、生长繁殖速度快、培养工艺简单等优点，因此是天然色素来源的首要选择[1]。

随着生活质量的提高，食品安全越来越受到重视，同时食品的颜色对消费者吸引也起着重要作用[2]。人工合成的色素工艺条件复杂、成本高、对生物毒性大，甚至有致癌风险，而天然色素无论是安全性还是色泽方面均存在着突出的优越性。在食品工业中，天然色素常被用作着色剂和抗氧化剂等[3]。同时，许多天然色素具有良好的药用价值，如姜黄素具有抗肿瘤、抗纤维化、肾脏保护、防治肥胖和抗炎等作用[4]。

蓝色素作为三原色之一，应用潜力巨大，然而其来源非常有限。已报道，天然蓝色素多由植物中提取，产蓝色素的微生物多局限在假单胞菌、放线菌、链霉菌及Janthinbacterium属菌，其中在链霉菌中报道最多[5-7]。因此，新型产蓝色素菌株的开发显得十分重要。

试验从江苏省镇江丹阳市的土壤中分离筛选获得一株产蓝色素的微生物，对其分子生物学鉴定及菌落形态的观察，并对色素的性质进行初步探究，以期为该菌株的利用奠定基础及为产天然色素的新型菌株开发拓宽领域。

1 材料与方法

1.1 土样

采自江苏省镇江市丹阳市。

1.2 培养基

LB培养基（液体，pH 7.5）：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L。固体培养基加入2%琼脂粉。

高氏1号培养基（液体，pH 7.5）：可溶性淀粉20 g/L，NaCl 0.5 g/L，KNO31.0 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L。固体培养基加入2%琼脂粉。

以上培养基均需115 ℃灭菌20 min。

1.3 试验仪器与设备

电子天平（ALC-1100.2，Sarforius）；恒温培养箱（DNP-9272，上海精宏）；超净工作台（CA-1390，江苏太仓）；pH计（SevenEasy S20，梅特勒）；台式离心机（5145D，Eppendorf）；高压灭菌锅（ES-315，Tomy）；光学显微镜（Motic）。

1.4 试验方法

1.4.1 菌株的筛选

称取2 g土壤溶于18 mL灭菌的无菌水中，振荡混匀后静止30 min，取上清液稀释至10-4，取100 μL稀释液涂布于高氏1号固体培养基上，放于30 ℃培养箱中培养5 d，挑取产蓝色素的菌体采用四区划线的方法分离单菌落，命名为DY-1，用高氏1号液体培养基培养至对数生长期后用50%的甘油保存菌种。

1.4.2 形态学观察与革兰染色

对固体培养基上长出来的菌体观察形态特征，高氏1号液体培养基长出的菌体用革兰染色，在光学显微镜下观察结果。

1.4.3 分子生物学鉴定

采用试剂盒获得菌株的基因组DNA，以基因组DNA为模板经扩增获得该菌株16S rRNA，送南京秉达生物科技有限公司测序。将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，采用MEGA软件构建系统进化树。

1.4.4 色素性质的探究

采用王海胜等[8]研究中报道的方法提取色素，进行色素性质的分析。

1.4.4.1 色素的溶解性测定

取500 mg色素粗提物，分别放置于2 mL无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、去离子水中，混合均匀，观察颜色的变化并根据最大吸收波长下的吸光度判定其溶解性。

1.4.4.2 色素吸光谱的测定

取5 g蓝色素的粗提物溶解在100 mL乙醇中，制得乙醇色素溶解液。利用分光光度计在190～480 nm处作大范围波长扫描，并记录其吸光度。

1.4.4.3 温度对色素稳定性的影响

取等体积的乙醇色素溶解液分别置于20，30，40和50 ℃的恒温水浴锅中2，4，6和8 h，测定其吸光度。

1.4.4.4 pH对色素稳定性的影响

取5 mL乙醇色素溶解液，分别用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液调节至pH 5，6，7，8和9，混合均匀后静止2，4，6和8 h，测定吸光度。

1.4.4.5 金属离子对色素稳定性的影响

分别配制浓度为100 mmol/L的Mn2+、Mg2+、Co2+、Cu2+离子溶液，取1 mL加入9 mL乙醇色素溶解液中，混合均匀，测定0 h和放置2，4和6 h后的吸光度。

1.4.4.6 光照对色素稳定性的影响

取1 mL乙醇色素溶解液在白光下分别放置0，2，4和6 h，测定其吸光度。

1.4.5 抑菌性研究

选取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌做抑菌性试验。每组取3片浸入乙醇色素提取液的直径9 mm的小滤纸片，分别置于3种菌的涂布平板上，并各放置1个浸入无水乙醇的滤纸片进行对照，在30 ℃培养24 h后观察是否有抑菌现象。

2 结果与分析

2.1 形态学特征及革兰染色结果

菌体与培养基结合较紧密，菌落凸起、边缘整齐、表面黏稠，蓝色素主要在菌落的上部，菌落背面呈乳白色（菌体形态特征见图1）。100倍物镜下观察到蓝色素呈现一种菱形结构（图2），革兰染色显示该菌株呈阴性（图3）。

图1 DY-1菌体形态

图2 蓝色素的显微形态

图3 DY-1革兰染色

2.2 菌株的分子生物学鉴定

16S rRNA测序结果经BLAST比对发现，其与Duganella pernnlastrain FT109W和Duganella margaritaFT134W序列相似度最高，亲缘关系最近，初步判断该菌株为杜檊氏菌属。

图4 DY-1系统进化树

2.3 色素性质的分析

2.3.1 蓝色素溶解度测定

将蓝色素样品分别加入不同的溶液中，发现样品易溶于无水乙醇，微溶于去离子水，不溶于丙酮、乙酸乙酯、甲醇。

2.3.2 蓝色素吸光谱的测定

如图5所示，紫外可见光吸收光谱显示该蓝色素乙醇溶液在220 nm处具有最高吸收峰。

图5 蓝色素乙醇溶液190～480 nm吸收光谱图

2.3.3 温度对蓝色素性质的影响

将蓝色素乙醇溶液分别在4个不同温度下避光保存2，4，6和8 h，测定波长220 nm处的吸光度。结果显示（图6），在20 ℃和30 ℃下，放置一段时间后，吸光度变化不明显，表明该蓝色素在20 ℃和30 ℃下具有一定稳定性。而在40 ℃和50 ℃下，吸光度随时间增长而均有增加，其中50 ℃增加较明显，由0 h的吸光度0.228增加至0.290，推测高温可能存在一定的增色效果。

图6 温度对蓝色素稳定性的影响

2.3.4 光照对蓝色素稳定性的影响

如图7所示，与0 h相比强光照射2，4和6 h后，色素残存率分别为91.8%，85.7%和78.6%，表明该色素对强光较敏感，宜黑暗保存。

图7 光照对蓝色素稳定性的影响

2.3.5 pH对蓝色素稳定性的影响

如图8所示，同一时间段，酸性或者碱性条件下蓝色素乙醇溶液在220 nm的吸光度与pH 7相比均有明显增高，说明酸和碱对蓝色素有增色效果。另外，放置4 h之后，在pH 5条件下蓝色素吸光度趋于平稳，而在pH 6，8和9的条件下，蓝色素吸光度均随时间延长下降明显，表明在这些条件下长时间放置会使酸碱的增色效应有所下降。

图8 pH对蓝色素稳定性的影响

2.3.6 金属离子对蓝色素稳定性的影响

如图9所示，Mn2+对蓝色素增色效果显著，6 h增色效果达到204%。Mg2+则有削减吸光度的现象，4 h由0.282降至0.156，降幅达到55.3%，之后趋于平稳。Co2+和Cu2+对蓝色素在短时间内（2 h）有增色效应，但随着放置时间的延长，增色效果减弱。

图9 金属离子对蓝色素稳定性的影响

2.4 蓝色素抑菌性鉴定

1，2和3号平板分别涂布大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌，标有“d”的滤纸片为乙醇对照组，其余为蓝色素乙醇溶液试验组。由图10可知，3个不同菌株的平板上均没有出现抑菌圈，表明该蓝色素对3种菌的生长均没有抑制效果。

图10 抑菌试验

3 结论

在高氏一号培养基上筛选获得一株产蓝色素的微生物，经16S rRNA测序结果，BLAST比对及系统进化的构建，判定该微生物为杜檊氏菌属。进一步对色素进行提取，结果表明该蓝色素易溶于无水乙醇，最大吸收波长在220 nm。强光、强酸和强碱对色素稳定性影响较大，20 ℃或30 ℃下储存有利于蓝色素的稳定。Mn2+对蓝色素具有明显的增色效应，Co2+和Cu2+对蓝色素的影响较小。该色素对大肠杆菌、酵母菌及枯草芽孢杆菌均没有抑制现象。