超临界CO2提取牡丹花精油及其抗氧化活性研究

王春杰，张立攀，赵梦瑶，王俊鹏，李冰，胡桂芳

河南省商业科学研究所有限责任公司（郑州 450000）

牡丹（Paeonia sufruticosaAndr.）为毛茛科芍药属植物，原产于我国，其颜色艳丽，被誉为“花中之王”[1]。牡丹花精油是从牡丹花瓣中提取分离出的具有芳香气味的挥发性油状物质。经研究，天然牡丹花精油具有较强的抗氧化、抗衰老等生理活性，可以缓解肌肤衰老、改善人体血液循环、促进细胞再生，在化妆品、保健品、功能食品等方面有着很好的应用前景[2-3]。2013年“丹凤”牡丹花被批准成为新食品原料[4]，前期已开展“香玉”牡丹花新食品原料申报工作；在缓解品种单一这一问题后，开发牡丹花香精产品，成为牡丹食品产业的紧迫需求。研究牡丹花精油及其提取工艺，是研发牡丹香精和化妆品的重要前提。

牡丹花精油的提取方法有多种。水蒸气蒸馏法因其操作简便、成本较低、设备简单，是最为常见的一种精油提取方法，但其提取效率低、能耗较高，热敏性成分在高温下易受到破坏[5]。有机溶剂提取法具有较高的提取率，但易产生溶剂残留，尤其不利于在食品领域的应用[6]。超临界二氧化碳流体萃取法（supercritical carbon dioxide fluid extraction，SFE-CO2）是借用超临界状态下CO2所具有的特异溶解性，对植物中的挥发性成分进行提取，通过调节温度和压力使溶解在超临界CO2中的植物精油与气化的CO2分开，达到选择性提取、分离化合物的目的；在提取过程中温度较低，可有效防止热敏组分分解，而且所得精油无溶剂残留，是一种高效绿色的提取技术。该技术已被应用于中药功能活性物质和香茅精油、迷迭香精油、玫瑰花精油、茉莉花精油等植物精油的提取[7-11]。

已有文献报道SFE-CO2提取牡丹籽油的工艺研究[12-15]，但应用于牡丹花精油的还较少。采用SFECO2法，在单因素试验基础上，以精油提取率为指标，对牡丹花精油提取工艺进行响应面优化，并通过Design-Expert软件对试验数据进行回归分析，获得最佳工艺。通过测定牡丹花精油对DPPH自由基的清除作用，对其抗氧化活性进行研究，为牡丹花精油开发及其利用，尤其是牡丹花精油在食品和化妆品方面的运用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牡丹花（品种为“香玉”，采摘无污染、无虫、无病牡丹花的盛开花朵，采摘时间为上午10点以前、下午4点钟以后，采自河南省洛阳祥和牡丹科技有限公司牡丹种植基地）；CO2（纯度99.99%，河南源正特种气体有限公司）；二苯代苦味麟自由基[DPPH，纯度＞97%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。

Spe-edTMSFE-2型超临界CO2提取装置（美国应用分离公司）；LGJ-12真空冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；TU-1901双光束紫外可见光分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；FA2004电子天平（上海衡际科学仪器有限公司）；QJ-08B粉碎机（上海兆申科技有限公司）；标准型分样筛（上虞市五四仪器厂）；AL204-ICF分析天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 牡丹花预处理

取新鲜牡丹花瓣，在真空冷冻干燥机中进行冻干处理，压力5 Pa，温度-35 ℃，时间15 h。冻干后的花瓣用粉碎机研碎，过筛，取0.300～0.425 mm孔径（40～50目）干粉，作为提取原料备用。

1.2.2 超临界CO2提取牡丹精油

称取5 g牡丹花冻干粉（0.300～0.425 mm，即40～50目）装入提取釜、密封，CO2气体经加热加压后通入釜中，待釜内达到设定的温度和压力后，进行连续提取，开启提取釜出口阀门，设置CO2流量5 L/min，动态提取一定时间后收集牡丹花精油，称其质量。按式（1）计算牡丹花精油提取率。

牡丹花精油提取率=牡丹花精油质量（g）/牡丹花粉末质量（g）×100% （1）

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 温度对提取率的影响

采用动态提取方式，固定压力25 MPa、时间1.75 h、CO2流量5 L/min、收集阀温度130 ℃，分别考察不同温度（30，35，40，45，50和55 ℃）对牡丹花精油提取率的影响，按照1.2.2的步骤提取牡丹花精油，并计算提取率。

1.2.3.2 压力对提取率的影响

采用动态提取方式，固定温度40 ℃、时间1.75 h、CO2流量5 L/min、收集阀温度130 ℃，分别考察不同压力（10，15，20，25，30和35 MPa）对牡丹花精油提取率的影响，按照1.2.2的步骤提取牡丹花精油，并计算提取率。

1.2.3.3 时间对提取率的影响

采用动态提取方式，固定温度40 ℃、压力25 MPa、CO2流量5 L/min、收集阀温度130 ℃，分别考察不同时间（1.75，2.00，2.25，2.50，2.75和3.00 h）对牡丹花精油提取率的影响，按照1.2.2的步骤提取牡丹花精油，并计算提取率。

1.2.4 响应面优化试验

在单因素试验基础上，以提取率为评价指标，时间、压力、温度为自变量，设计响应面试验，试验因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平表

1.2.5 数据分析

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，结合单因素试验结果，选取时间、温度、压力3个因素为自变量，以牡丹花精油提取率（Y）为响应值，运用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析并得到最佳提取工艺参数。每组试验重复3次，结果取平均值。

1.2.6 牡丹花精油对DPPH自由基清除能力测定

配制DPPH乙醇溶液：准确称取6 mg DPPH，用无水乙醇定容至250 mL，得到60 μmol/L的DPPH乙醇溶液；置于0～4 ℃避光保存，现配现用，4 h内有效。

配制测试液：将牡丹花精油用无水乙醇进行稀释，分别得到质量浓度为5.62，2.81，1.40，0.70，0.35，0.18和0.09 mg/mL的待测液。

牡丹花精油对DPPH自由基清除能力的测定，参考毛文岳等[16]的方法。准确量取1 mL待测液、1 mL无水乙醇，分别与1 mL DPPH 乙醇溶液混匀，反应30 min后，在517 nm处测定吸光度，分别记为A1和A2；量取1 mL待测液与1 mL无水乙醇混匀，反应30 min后在517 nm 处测定吸光度A0，用无水乙醇调零，以抗坏血酸作为阳性对照，平行操作重复3次。清除率按式（2）计算。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 温度的影响

由图1可知，随着温度不断升高，提取率起初呈现上升趋势，温度40 ℃时达到最高。这是因为升高温度可以加快分子运动速率，提高溶质及溶剂分子的扩散能力，使得传质能力增强，牡丹精油溶出加快[17]。但是，温度升高也会使超临界CO2密度降低，溶剂化能力减小，温度过高时，密度减小的影响更为显著，导致提取率开始下降。所以温度选择40 ℃。

图1 温度对牡丹花精油提取率的影响

2.1.2 压力的影响

由图2可知，提取率随着压力的增加呈现先增加后降低趋势。压力增加使得CO2密度增加，有利于传质、提高提取效率。压力过大时会导致超临界CO2黏度增大，影响传质速率，使得精油溶解度降低，造成提取率低[18]。同时，压力过高时对设备的要求较高，增加操作时的安全风险。所以压力选取25 MPa。

图2 压力对牡丹花精油提取率的影响

2.1.3 时间的影响

由图3可知，随着时间的增加，提取率逐渐增大，时间达到2.5 h后，提取率随着时间的增加而趋于稳定。这是因为随着时间的延长，溶质分子在逐渐溶出的过程中逐渐达到饱和[19]。过长的时间会导致CO2的消耗增大，成本增加，因此时间选择2.5 h。

图3 时间对牡丹花精油提取率的影响

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面法试验设计

根据单因素的试验结果，以牡丹花精油提取率（Y）为响应值，以温度（A）、压力（B）和时间（C）为响应因素，通过Design-Expert软件设计牡丹花精油提取工艺的响应面优化试验，结果见表2。

表2 Box-Behnken设计及结果

2.2.2 响应面分析

对表2结果进行多元回归拟合分析，得到模型回归方程：Y=2.25+0.103 7A-0.021 3B+0.037 5C-0.03AB-0.007 5AC-0.092 5BC-0.092 5A2-0.092 5B2-0.105C2。对回归模型进行方差分析，结果见表3。此模型P值为0.000 7，小于0.05，说明模型结果显著，具有统计学意义。失拟项P值为0.828 9，大于0.05，结果不显著，说明该模型与试验结果拟合程度较好，无失拟因素。R2=0.095 29，调整决定系数Radj2=0.892 3，大于0.80，进一步证明该模型与试验结果拟合程度较好，可用来对牡丹花精油SFE-CO2提取工艺进行分析和预测。根据表3中F值可知，影响提取率大小的因素依次为时间（A）＞压力（C）＞温度（B）。此外，通过P值可知A、BC、A2、B2、C2对精油提取率有极显著影响（P＜0.01），C对精油提取率有显著影响（P＜0.05）。

表3 回归模型方差分析表

为考察温度、压力和时间及交互作用对提取率的影响，通过Design-Expert软件绘制任意2个因素交互作用对提取率影响的响应面图及等高线图，如图4所示。

模型的响应曲面与等高线的形状能够反映因素变量对响应值的影响和因素之间交互作用的显著性，即曲面越陡，因素的影响越显著；等高线图为椭圆形且曲率越大代表两者交互作用强[20]。由图4（a和b）可知，等高线沿A轴变化比B轴、C轴都更加密集，表明时间比温度和压力对响应值的影响均要大，AB、AC的交互作用都不很显著。图4（c）中等高线呈椭圆形，表明温度和压力之间的交互作对牡丹花精油的提取率影响最大，这与表3中的结果相一致。BC的F值为17.85，远高于AB和AC的F值，表明BC的交互作用影响最强，要大于AB、AC的交互作用。

图4 两因素交互作用对牡丹花精油提取率的影响

根据响应面试验分析得到最优的超临界CO2提取牡丹花精油的工艺条件：时间2.65 h、温度38.1 ℃、压力26.6 MPa。软件预测该条件下牡丹精油提取率为2.29%。为了验证软件预测结果的可靠性，结合实际操作，将最优工艺条件调整为温度38 ℃、压力27 MPa、时间2.7 h。在最优工艺下进行3次平行试验，所得牡丹花精油的平均提取率为2.26%，与理论值相接近，说明该工艺条件准确可靠。

2.3 牡丹花精油对DPPH自由基清除能力测定

由图5可知，在牡丹花精油浓度在0.09～2.81 mg/mL范围内，随着牡丹花精油浓度的增加，精油对DPPH自由基清除率逐渐增高，质量浓度达到2.81 mg/mL时，DPPH自由基清除率为72.6%，随着精油浓度继续增加，精油对DPPH自由基清除率呈现逐渐稳定趋势。通过SPSS统计软件进行回归分析，得到牡丹花精油的IC50为1.783 mg/mL。相比于VC来说，牡丹花精油对DPPH自由基的清除作用较弱。

图5 牡丹花精油对DPPH自由基的清除作用

3 结论

通过单因素试验和响应面法优化超临界CO2提取牡丹花精油的工艺条件，方差分析结果表明，影响提取率大小的因素依次为时间（A）＞压力（C）＞温度（B）。压力和温度之间具有较强的交互作用。结合Design-Expert软件预测的结果及实际操作的可行性，将最终的优化工艺定为温度38 ℃、压力27 MPa、时间2.7 h。超临界CO2法提取得到的牡丹花精油具有较强的抗氧化活性，IC50为1.783 mg/mL。试验结果为牡丹花精油的生产、加工提供一定的理论依据，促进牡丹的精深加工。