不稳定型心绞痛患者心外膜脂肪组织厚度及IL-1β表达水平与冠状动脉易损斑块形成相关性分析

陈博，谈金强 ，祝和成，张峰，刘强

1 济南市第四人民医院心内科 济南市心血管病研究所，济南 250031；2 济南市济阳区人民医院心内科；3 济南市第四人民医院心脏与大血管外科

心外膜脂肪组织（EAT）具有重要的代谢功能，是炎症因子的重要来源，与冠状动脉粥样硬化存在密切联系［1-2］。既往研究发现，EAT厚度与急性心肌梗死患者冠状动脉病变严重程度存在相关性［3］。近期，有研究通过多层螺旋CT评估冠状动脉斑块及EAT体积，发现EAT体积与易损斑块（VP）存在相关性［4］。但受限于分辨率，多层螺旋CT对VP的识别可能存在一定局限性。EAT可产生白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6等炎症因子，IL-1β是炎症反应和免疫调节的关键因子，与多种心血管疾病相关［5-7］。炎症是动脉粥样硬化的重要致病机制，外周循环和EAT局部的IL-1β都可能会影响粥样斑块的稳定性，但目前还没有明确结论。因此，本研究拟探讨EAT厚度及其组织中IL-1β与冠状动脉VP的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经济南市第四人民医院医学伦理委员会批（批准号LL-20210006），选取2017年12月—2019年11月我院收治的不稳定型心绞痛患者。纳入标准：接受冠状动脉造影和冠状动脉血管内超声（IVUS）检查确诊为冠状动脉粥样硬化性心脏病；接受择期冠状动脉旁路移植术；患者签署知情同意书。排除标准：合并急性心肌梗死、活动性炎症、既往冠状动脉血运重建病史、急性心力衰竭、冠状动脉慢性完全闭塞、心肌病、肿瘤。共收集符合上述条件的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者63例，进一步对患者冠状动脉造影后对狭窄≥50%的主要血管进行IVUS检查，并进行虚拟组织学分析。VP定义为至少连续三帧图像上同时满足斑块负荷≥50%、坏死核心占斑块面积比例≥10%、坏死核心表面无纤维斑块成分［8］。根据虚拟组织学IVUS定义的VP将患者分为VP组24例，非VP组39例。同时，纳入排除冠状动脉粥样硬化性心脏病需接受换瓣手术的心脏瓣膜病患者45例作为对照组。VP组男17例、女7例，年龄（65 ± 10）岁，BMI（24.5 ±3.2）kg/m2，收缩压（142 ± 31）mmHg、舒张压（79 ± 13）mmHg，心率（77 ± 14）次/分，高血压11例，高脂血症9例，吸烟10例，糖尿病8例，有冠心病家族史10例，总胆固醇（4.81 ± 1.07）mmol/L，高密度脂蛋白（1.15 ±0.19）mmol/L，低密度脂蛋白（2.91 ± 0.89）mmol/L，糖化血红蛋白6.1% ± 0.8%，左心室射血分数57% ±7%；非VP组男23例、女16例，年龄（68 ± 11）岁，BMI（23.7 ± 3.6）kg/m2，收缩压（141 ± 25）mmHg、舒张压（79 ± 11）mmHg，心率（72 ± 17）次/分，高血压16例，高脂血症14例，吸烟15例，糖尿病14例，有冠心病家族史14例，总胆固醇（4.64 ± 1.14）mmol/L，高密度脂蛋白（1.28 ± 0.24）mmol/L，低密度脂蛋白（3.08 ±0.90）mmol/L，糖化血红蛋白5.9% ± 0.9%，左心室射血分数59% ± 8%；对照组男32例、女13例，年龄（62 ±12）岁，BMI（22.8 ± 3.3）kg/m2，收缩压（143 ± 29）mmHg、舒张压（81 ± 20）mmHg，心率（80 ± 15）次/分，高血压9例，高脂血症9例，吸烟8例，糖尿病5例，有冠心病家族史10例，总胆固醇（4.86 ± 1.18）mmol/L，高密度脂蛋白（1.23 ± 0.26）mmol/L，低密度脂蛋白（3.0 ± 0.93）mmol/L，糖化血红蛋白5.7% ± 0.9%，左心室射血分数56% ± 15%。三组年龄、性别、BMI、收缩压、舒张压、心率、血脂水平、左心室射血分数差异无统计学意义，高脂血症、糖尿病、高血压、吸烟、冠心病家族史等传统冠心病危险因素在VP组及非VP组中发生率高于对照组（P均＜0.05），VP组与非VP组各临床资料差异均无统计学意义。

2.2 EAT厚度测量方法 所有受试者均接受超声心动图检查（飞利浦EPIQ-7C），检查由同一名经验丰富的超声诊断医生进行，选择胸骨旁长轴切面测量右心室舒张末期游离壁的脂肪厚度［3］。选择心脏S5-1探头，频率为3.5 MHz，深度设置15 cm。为减少误差，将感兴趣区放大以便于测量。连续测量3个心动周期的EAT厚度数值，取平均值。

2.3 血浆IL-1β表达检测 采用ELISA法。采集受试者空腹肘静脉血，血浆标本置于-80 ℃储存，按照ELISA反应试剂盒（武汉谷歌生物科技公司）说明书测定血浆IL-1β。

2.4 EAT中IL-1β蛋白及mRNA表达检测 开胸术后30 min内在患者右冠状动脉近段心外膜区域取EAT中标本，用磷酸盐缓冲盐水冲洗标本，并在-80 ℃下保存。①IL-1β蛋白表达：采用免疫组织化学法。将石蜡包埋的EAT标本连续切片，采用Envision二步法进行IL-1β免疫组化染色，一抗为抗IL-1β抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体（武汉谷歌生物科技公司）。免疫组织化学检测试剂盒由武汉谷歌生物科技公司提供，IL-1β蛋白阳性表达为棕黄色或黄色颗粒状物质。②IL-1β mRNA表达：采用RT-PCR。取EAT标本50 μg，采用TRIzol法提取总RNA，反转录为cDNA，PCR扩增。PCR反应条件为：95 ℃ 45 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，循环30次。引物由武汉谷歌生物科技公司合成，IL-1β上游引物5'-TGGGATAACGAGGCTTATGTG-3'，下游引物5'-ATGGAGAACACCACTTGTTGC-3'；GAPDH上游引物5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC -3'，下 游 引 物5'-GGAGCAATGATCTTGATCTTCA-3'。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算IL-1β相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov正态性检验验证是否服从正态分布，以±s表示，两组数据比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析及Bonferroni校正；计数资料以例或百分比表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman等级相关性分析VP组、非VP组EAT厚度及EAT中IL-1β水平与冠状动脉VP的相关性，多因素Logistic回归分析不稳定型心绞痛患者发生VP的影响因素，受试者工作特征（ROC）曲线评价EAT厚度对冠状动脉VP的预测价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组EAT厚度比较 VP组、非VP组、对照组EAT 厚度分别为（6.1 ± 1.3）mm、（5.4 ± 1.5）mm、（4.6 ± 1.4）mm，EAT厚度VP组＞非VP组＞对照组（P均＜0.05）。

2.2 各组血浆IL-1β表达比较 VP组、非VP组、对照组血浆IL-1β表达分别为（0.25 ± 0.24）、（0.25 ±0.35）、（0.24 ± 0.36）pg/dL，三组血浆IL-1β表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组EAT中IL-1β蛋白及mRNA表达比较免疫组化染色显示，EAT中IL-1β蛋白在VP组表达最多（OSID码图1）。VP组、非VP组、对照组EAT中IL-1β mRNA表达分别为6.13 ± 2.14、2.60 ± 0.93、2.09 ± 0.84，IL-1β mRNA表达VP组＞非VP组、对照组（P＜0.05）。

2.4 VP组、非VP组EAT厚度及EAT中IL-1β水平与冠状动脉VP的相关性 Spearman相关性分析显示，VP组、非VP组EAT厚度及EAT中IL-1β水平均与冠状动脉VP呈正相关（r分别为0.34、0.67）。

2.5 不稳定型心绞痛患者发生VP的影响因素 多因素Logistic回归分析显示，EAT厚度、EAT中IL-1β水平是不稳定型心绞痛患者发生VP的独立影响因素。见表1。

表1 不稳定型心绞痛患者发生VP的多因素Logistic回归分析结果

2.6 EAT厚度对冠状动脉VP的预测价值 ROC曲线分析显示，EAT厚度预测冠状动脉VP的曲线下面积为0.74（95%CI为0.64～0.84）；当EAT厚度截断值为4.4 mm时，预测冠状动脉VP的敏感度和特异度分别为95.8%和45.2%。见图1。

图1 EAT厚度预测冠状动脉VP的ROC曲线

3 讨论

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病［9］，炎症参与了动脉粥样硬化发生发展的各个阶段。炎症因子可以促进斑块的形成，加快稳定斑块进展为不稳定斑块［10-11］。CHOI等［12］对人体动脉粥样斑块进行了动态随访，发现炎症参与了VP的形成，而抑制炎症活动可以增加斑块的稳定性；如果相关的炎症途径被选择性阻断，斑块体积会显著减小。

斑块破裂是急性冠脉综合征最重要的致病机制。尽管近年来对动脉粥样硬化的研究取得了很大的进展，但斑块破裂的机制仍不完全清楚。一种观点认为，局部炎症因子可以释放蛋白酶，抑制纤维帽形成，导致斑块不稳定［13］。本研究结果显示，EAT中存在关键炎症因子IL-1β，且存在VP的患者EAT中IL-1β表达显著增加，但IL-1β通过何种机制影响斑块的稳定性还尚未可知。既往研究表明，IL-1β基因敲除小鼠动脉粥样硬化严重程度显著降低［14］。相关临床研究也发现，针对IL-1β的治疗可以改善心肌梗死患者预后，在标准治疗基础上加用IL-1β单克隆抗体可以将心肌梗死后心血管事件的发生风险降低15%［15］。因此，IL-1β信号途径在VP的形成机制中可能有重要作用。本研究发现，VP患者EAT中IL-1β表达增加，支持IL-1β影响斑块稳定性的观点。外周循环中也可以检测到IL-1β表达，但我们的研究发现外周循环中IL-1β水平与是否存在冠状动脉VP无关。一种可能的解释是：EAT局部IL-1β表达增加，可通过旁分泌形式作用于冠状动脉粥样斑块，从而促进斑块不稳定。

EAT是包裹在心脏和冠状动脉表面的脂肪组织。在成年人心脏中，EAT覆盖80%的心脏表面，大部分位于右心室表面。这也是本研究选择右室游离壁作为超声心动图测量部位的原因。EAT和冠状动脉之间有紧密的解剖和功能联系，因此两者间可能存在相互作用［16］。研究发现，EAT可通过内分泌和旁分泌产生炎症因子和趋化素，而炎症反应是粥样斑块形成、发展的重要因素，导致斑块趋向于不稳定［17］。本研究结果显示，EAT产生的IL-1β可能是影响冠状动脉粥样斑块性质的一个重要因素。目前临床上多采用CT或MRI测量EAT体积来探讨其与心血管疾病的关系［17-18］。有研究发现，血清趋化素水平与EAT体积相关，可以预测患者心血管疾病发生的风险［17］。对房颤患者的研究发现，CT测量的EAT体积与心房电重构、结构重构相关，与房颤发生及射频消融术后复发相关［19］。但这两种检查效率较低，可重复性差，难以普遍用于临床筛查。超声心动图测量EAT厚度更为高效、经济，可进行大样本研究，并且易于动态随访观察。本研究结果表明，存在冠状动脉VP的患者EAT厚度显著增加，并且EAT厚度及EAT中IL-1β水平是VP的独立预测因子。

本研究存在一定的局限性。首先，冠状动脉VP在临床上较难界定，血管内超声定义的VP并不完全等同于病理学定义的VP，但目前血管内超声结合虚拟组织学是较为准确的检测VP的方式。其次，这是一项单中心研究，同时满足接受血管内超声检查及外科开胸手术的患者较难收集，因此入选患者数量有限。未来需要多中心、大样本的研究来进一步验证本文的发现并阐明EAT产生的IL-1β在VP形成中的具体作用机制。