无呼吸性气流通气对胸腔镜下肺癌根治术单肺通气患者非通气侧肺损伤的改善作用及其机制

周俊辉，钟巍，奚高原，王鹏浩

河南省胸科医院 郑州大学附属胸科医院麻醉科，郑州 450000

单肺通气（OLV）在胸外科手术中应用广泛，但其易引起非通气侧肺的机械性损伤及缺血再灌注损伤，从而导致肺损伤的发生，影响患者预后。有学者发现，OLV期间通过纤维支气管镜对非通气侧肺选择性地给予5 L/min氧气输送可增加患者氧合而不影响手术视野，即为无呼吸性气流通气（AOI），亦称为非通气侧肺持续给氧［1］。研究显示，在不施加通气压力的情况下，提供非通气侧肺AOI可有效改善患者术中氧合状态，预防低氧血症的发生且不中断手术、不妨碍术野，从而为胸外科手术期间提供更好的手术条件［2］。然而，AOI在减轻非通气侧肺损伤中的可能机制仍未可知。本研究拟探讨AOI对行OLV胸腔镜下肺癌根治术的患者非通气侧肺损伤的改善作用及其机制，以期为AOI在OLV中的应用提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经河南省胸科医院医学伦理委员会批准［伦理批号：（2018）伦申第（12-08）］，选择2019年3月—2020年5月本院收治的择期行胸腔镜下肺癌根治术患者。基于胸腔镜下肺癌根治术患者肺损伤评分经干预后下降约50%［3］的假设计算样本量，参数设定为双侧检验，检验水准=0.05、检验效能=0.9，失访率15%，则共需要受试者60例。纳入标准：年龄40～65岁，体质量40.0～80.0 kg，身高150.0～180.0 cm，美国麻醉医师协会（ASA）分级Ⅱ～Ⅲ级，血液动力学稳定，对研究过程知情并签署知情同意书。排除标准：存在全身性感染、慢性肺部疾病、怀孕、肾脏疾病、影响四肢功能的外周动脉疾病、复杂性冠心病、复杂高血压、先天性心脏瓣膜病、术前中风，入院期间发生过心脏骤停。将符合标准的60例患者使用计算机生成随机数序列，按照1∶1的比例随机分配到AOI组及对照组，每组30例。对照组男15例、女15例，年龄（51.7 ± 7.5）岁，BMI（23.8 ± 3.1）kg/m2，ASA分级Ⅱ级19例、Ⅲ级11例，术前一秒用力呼气容积（FEV1）/用力肺活量（FVC）76.7% ± 5.5%，术前动脉血氧分压（PaO2）为（88.6 ± 5.9）mmHg，术前动脉二氧化碳分压（PaCO2）为（41.6 ± 3.4）mmHg，OLV部位左肺18例、右肺12例，OLV时长（127.7 ± 21.8）min，双肺通气时长（66.8 ± 14.9）min，手术总时长（163.5 ±28.6）min，麻醉总时长（181.4 ± 31.3）min，失血量（347.6 ± 68.9）mL，液体入量（1 452.6 ± 234.8）mL；AOI组男16例、女14例，年龄（50.6 ± 8.0）岁，BMI（24.0 ± 3.2）kg/m2，ASA分级Ⅱ级17例、Ⅲ级13例，术前FEV1/FVC 77.5% ± 5.8%，术前PaO2（90.1 ±5.6）mmHg，术前PaCO2（42.0 ± 3.6）mmHg，OLV部位左肺19例、右肺11例，OLV时长（130.4 ± 22.5）min，双肺通气时长（68.3 ± 16.1）min，手术总时长（165.7 ±27.3）min，麻醉总时长（183.5 ± 33.8）min，失血量（350.2 ± 70.5）mL，液体入量（1 462.6 ± 244.7）mL。两组患者性别、年龄、BMI、ASA分级、术前FEV1/FVC、术前PaO2、术前PaCO2、OLV 时长等一般资料均具有可比性（P均＞0.05）。

1.2 手术麻醉及肺部通气方法 所有患者均由同一组胸外科医师团队通过标准后外侧视频辅助胸腔镜行肺癌根治术，术中仔细游离癌变肺叶的血管和支气管，清扫系统淋巴结。麻醉方法：患者进入手术室后吸氧，监护心电图、脑电双频谱指数（BIS）及血氧饱和度。建立上外周静脉输液通路，输注醋酸钠林格液。2 mg咪达唑仑进行预处理，依托咪酯进行麻醉诱导，罗库溴铵进行肌肉松弛，用可视双腔气管管进行气管插管，机械通气，丙泊酚、七氟醚、罗库溴铵及瑞芬太尼维持。术中通气维持在6 mL/kg+5 cm呼气末正压通气（PEEP），目标为将气道峰值压力控制在30 cm H2O以下，以呼吸频率进行容量或压力控制通气，使PaCO2保持在30～45 mmgHg。OLV开始即刻，给予AOI组患者非通气侧肺5 L/min氧气的持续性通气，对照组患者非通气侧肺不给予持续性通气。术毕时行超声引导下胸椎旁神经阻滞，静脉推注舒更葡糖钠注射液2 mg/kg以拮抗罗库溴铵。当符合麻醉医师评估的拔除气管导管标准时进行拔管。患者气管导管拔除后均被送入麻醉后监护室（PACU）以接受后续诊疗。

1.3 动脉氧合参数检测 分别在麻醉诱导后即刻（T0）、OLV 后 30 min（T1）、OLV 后 1 h（T2）及 OLV 后2 h（T3），用含有肝素的注射器采集患者桡动脉血液，将动脉血样立即注入血气分析试管中，采用SIEMENS RAPIDPoint 500血气分析仪（德国西门子公司）进行血气分析，测量氧合参数PaO2和PaCO2。

1.4 肺组织损伤情况观察 采用HE染色。手术结束时留取已切除肺肿瘤周围正常的肺组织，置入4%甲醛溶液24 h进行标本固定，乙醇脱水，石蜡包埋，将组织切成厚度5 μm的切片，中性树脂密封。将切片转移到载玻片上，使用试剂盒进行HE染色，SZ51光镜（日本Olympus公司）观察肺组织病理学变化。肺组织损伤的评分为水肿、中性粒细胞浸润、出血、细支气管上皮脱屑和透明膜形成，0分表示没有或非常轻微、1分表示中等和有限、2分表示中等、3分表示广泛或突出、4分表示广泛和最突出，各项相加累计总分即为肺损伤评分［4］。

1.5 肺组织细胞凋亡情况观察 采用TUNEL法。使用TUNEL细胞凋亡测定试剂盒（德国Roche公司）试剂盒检测和量化细胞凋亡，严格按照试剂盒说明书操作。高倍镜（×400）下对患者的10个随机肺组织切片进行分析，出现凋亡的细胞胞核为褐色，将TUNEL阳性细胞百分比表示为细胞凋亡指数。

1.6 肺组织细胞凋亡及自噬相关蛋白表达检测采用Western blotting法。取各组肺组织，提取总蛋白质，通过二辛可宁酸蛋白检测试剂盒测试每种蛋白质样品浓度。对50 μg蛋白质样品进行凝胶电泳，在20 V下跨膜1 h至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。一抗封闭采用5%脱脂牛奶，将细胞凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）一抗，自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1一抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司）及GAPDH一抗（美国Cell Signaling Technology公司）稀释为1∶1 000及1∶2 000，4 ℃下孵育过夜。将二抗即辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体稀释为1∶10 000，将PVDF膜加入二抗，室温下孵育1 h，PVDF膜显影、定影。采用Image J 2.1软件对上述蛋白表达进行半定量分析，以GAPDH为内参，计算目的蛋白与GAPDH蛋白灰度值的比值，作为目的蛋白的相对表达量。

1.7 术后不良事件发生情况观察 记录术后3 d内患者发生的不良事件，包括呼吸抑制（呼吸频率＜12次/分）、窦性心动过缓（心率＜50次/分）、窦性心动过速（心率＞100次/分）、低血压（收缩压相对基线降低20%）、高血压（收缩压相对基线升高20%）及恶心呕吐。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk进行正态性检验，呈正态分布的数据以±s表示，组间比较行t检验，组内不同时点比较采用重复测量的方差分析；非正态分布的数据以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以n（%）表示，组间比较行χ2检验或Fisher精确检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组不同时点氧合参数比较 见表1。

表1 两组不同时点PaO2、PaCO2比较（mmHg，±s）

注：与同组T0时点比较，*P＜0.05；与对照组同时点比较，#P＜0.05。

组别对照组T0 T1 T2 T3 AOI组T0 T1 T2 T3 n 30 30 PaO2 311.2 ± 40.7 88.7 ± 20.5*97.8 ± 23.3*91.7 ± 20.8*310.5 ± 41.6 125.4 ± 33.1*#187.5 ± 43.5*#193.6 ± 45.7*#PaCO2 36.3 ± 3.7 44.4 ± 4.1*44.9 ± 3.7*44.5 ± 3.6*37.1 ± 3.3 41.2 ± 3.5*#40.2 ± 4.4*#42.3 ± 3.5*#

2.2 两组肺组织损伤情况比较 HE染色结果显示，对照组肺泡肿胀，壁厚，其内可见渗液，可观察到严重的炎症细胞浸润；AOI组较对照组肺泡水肿液渗出减少，肺间质增厚和炎症细胞浸润均明显改善。见OSID码图1。对照组、AOI组肺损伤评分分别为（8.6 ± 1.2）、（4.2 ± 0.8）分，AOI组肺损伤评分低于对照组（P＜0.05）。

2.3 两组细胞凋亡指数比较 对照组、AOI组细胞凋亡指数分别为21.5% ± 7.4%、9.3% ± 3.1%，AOI组细胞凋亡指数低于对照组（P＜0.05）。

2.4 两组细胞凋亡及自噬相关蛋白比较 见表2、3。

表2 两组细胞凋亡相关蛋白比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别对照组AOI组n 30 30 Bcl-2 0.46 ± 0.06 0.70 ± 0.12*Bax 0.69 ± 0.11 0.51 ± 0.07*Bcl-2/Bax 0.69 ± 0.12 1.23 ± 0.19*

表3 两组细胞自噬相关蛋白比较（±s）

表3 两组细胞自噬相关蛋白比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别对照组AOI组n 30 30 Beclin-1 0.79 ± 0.16 0.54 ± 0.11*LC3-Ⅰ0.43 ± 0.08 0.66 ± 0.11*LC3-Ⅱ0.74 ± 0.15 0.52 ± 0.10*LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.40 ± 0.22 0.91 ± 0.14*

2.5 两组术后不良事件发生情况比较 对照组术后1例发生呼吸抑制、2例发生窦性心动过缓、3例发生窦性心动过速、2例发生高血压、1例发生低血压、1例发生口干、1例有恶心及呕吐；AOI组术后2例发生呼吸抑制、3例发生窦性心动过缓、4例发生窦性心动过速、4例发生高血压、2例发生低血压、2例发生口干、无恶心呕吐发生，两组术后不良事件发生情况比较无统计学差异（P均＞0.05）。

3 讨论

OLV是一种麻醉管理技术，可在胸科手术中提供极大的帮助。由于其特殊性和专业性，在操作中需要有关气道管理、维持气体交换和预防急性肺损伤的特定技能和知识，而保持足够的气体交换和减少急性肺损伤可能是一个矛盾的过程［5］。OLV开始后，非通气侧肺不再供应空气或氧气，然而该侧肺的血供仍然正常运作，从而会导致肺内分流率（Qs/Qt）显著增大［6］。评估呼吸窘迫的严重程度一直是判断肺功能的重要临床手段，用于评估肺部疾病严重程度及其对氧合影响的各种客观测量指标有许多种，常用的参数有PaO2与氧吸入浓度（FiO2）比及肺泡小动脉氧差（A-aDO2）等。在FiO2和其他呼吸参数不变的情况下，OLV开始后A-aDO2逐渐增大，PaO2则逐渐降低。本研究结果显示，OLV开始后对照组及AOI组氧合状态均下降，而AOI组的氧合状态高于对照组，提示患者AOI可改善患者呼吸窘迫状态，对肺功能起到保护作用。PaCO2在临床上常用于判断呼吸衰竭类型、是否出现呼吸性酸碱平衡失调、代谢性酸碱失调的代偿反应及肺泡通气情况。本研究结果显示，与OLV开始后不给予AOI相比，给予AOI可降低术中不同时点的PaCO2，提示AOI可减少OLV时因通气不足引起的CO2蓄积，避免出现呼吸性酸碱失衡。

AOI技术是在不通气的一侧肺通过纤维支气管镜给予流速为5 L/min的持续性给氧，可显著改善患者的氧合功能，但不影响手术操作。目前，AOI已成功应用于硬质支气管镜检查、内窥镜检查和气管内插管。然而有部分观点认为，AOI在OLV中并无有效作用，其原因为肺暴露于大气压下萎陷到一定程度后气道就会关闭［7］。但本研究团队在前期研究中发现，当肺充满氧气时，未通气的肺会缓慢塌陷，缺氧性肺血管收缩进展缓慢，因此，AOI可能有助于预防肺组织缺氧并可增加OLV期间的PaO2［8］。本研究结果同样提示，AOI在OLV中可以改善非通气侧肺的肺组织损伤，从而起到积极的作用。

本研究根据吴唐静等［9］提供的研究方法，在可视化操作下对非通气侧肺持续输注5 L/min的氧气，即在OLV期间给予AOI。有研究显示，OLV开始后给予AOI可提升患者的氧合状态，使Qs/Qt下降［10］。本研究结果显示，AOI组肺损伤评分较对照组显著下降，提示AOI可减轻患者非通气侧的急性肺损伤。此外，OLV组肺组织病理结构也受到严重影响，提示OLV 2 h可严重影响肺功能，这与以往研究中OLV 1 h可增加肺损伤发生率是一致的［11］。OLV后再次进行通气的肺暴露于高应变，继发非生理性潮气量和正常功能残气量的丧失。同时，再次进行通气的肺可诱发缺氧/复氧所致的氧化应激反应和机械通气所引起的毛细血管剪切应力。塌陷肺的手术操作和/或切除可能会导致肺损伤。OLV结束、双肺通气开始后，萎陷的肺脏再次膨胀，进而诱发缺血再灌注肺损伤，炎症因子大量释放，再次加重肺损伤［8］。本研究从OLV开始即刻给予非通气侧肺持续的氧气通气，减轻了肺损伤。因此，AOI是一种有效的肺保护手段。

缺血再灌注通过快速激活免疫系统诱发炎症和损伤，肺缺血再灌注损伤的潜在机制涉及炎症因子的释放及其表达的增加，从而导致肺细胞凋亡［12］。Bcl-2家族包括抗凋亡基因如Bak、Bcl-2和Bcl-xL以及促凋亡基因如Bad和Bax。Bcl-2家族成员已被证明可以预防肺上皮细胞凋亡，Bcl-2可以与Bax结合形成Bcl-2/Bax异二聚体调节细胞凋亡，Bcl-2/Bax的比值决定了缺血性疾病中细胞的存活率，即当Bcl-2占主导地位时，细胞可存活［13］。本研究结果显示，Bcl-2过表达减少了细胞凋亡，同时也增加了Bcl-2/Bax的表达，导致细胞凋亡指数明显降低。因此，AOI可能通过抑制细胞凋亡而减轻肺损伤。

自噬是一种分解代谢的细胞过程，可以维持细胞稳态和存活。肺缺血再灌注后自噬水平升高，细胞凋亡增加，这已得到广泛的认可。抑制过度自噬可以减轻各种病理条件下的组织损伤，维持中等水平的自噬可能有助于减少缺血再灌注诱导的肺损伤并促进体内细胞存活。Beclin-1是自噬启动的标志性蛋白之一，其表达可以预测自噬的发生情况。作为第一个被发现的自噬标志性蛋白，LC3表达强弱常可反映自噬的严重程度。当自噬形成时， LC3-Ⅰ可酶解掉一小段多肽，从而转变为LC3-Ⅱ。因此，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值的大小可估计自噬水平的高低。本研究探索了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1的表达，发现AOI组Beclin-1蛋白表达、LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ较对照组降低，提示AOI组自噬水平减轻。自噬能够选择性降解受损的细胞器和蛋白质聚集体，而细胞凋亡则可去除受损或老化的细胞，因此维持自噬和细胞凋亡之间的平衡对于细胞命运至关重要。本研究结果显示，AOI在一定程度上调节了肺缺血再灌注引起的细胞自噬及凋亡之间的平衡紊乱，有益于肺保护。同时，本研究中两组术后不良事件包括呼吸抑制、窦性心动过缓、窦性心动过速、高血压、低血压、口干、恶心及呕吐等发生例数均较少，且两组间比较无统计学差异，提示AOI应用于胸腔镜下肺癌根治术患者具有较高的安全性，可在临床上推广应用。

综上所述，OLV期间行AOI可改善胸腔镜下肺癌根治术患者非通气侧肺损伤且安全性良好，该机制可能与AOI改善肺组织氧合状态，抑制细胞凋亡及自噬有关。本研究尚存在如下局限性∶首先，样本量偏小，证据等级相对较低；其次，出于安全考虑，本研究排除了患有严重肺部疾病的患者，而纳入易受OLV影响患者的研究设计可能更适合本研究的假设；最后，非通气侧肺AOI可减轻患者非通气侧肺损伤的作用机制可能有多种，故需要进一步的研究去探讨。