乳腺癌组织中环状RNA CDR1as及miR-483-5p表达特点及临床意义

沈蓉 陈淼

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，且有发病率逐年升高和年轻化的趋势。尽管早期发现和放疗可以显著降低乳腺癌的病死率，但是乳腺癌的高转移性和高扩散性使患者的预后较差[1，2]。环状 RNA CDR1as 和miR-483-5p 是一类非编码RNA，不仅参与细胞的增殖、迁移和凋亡，还参与先天免疫等，而且在多种疾病的发病中起着至关重要的作用[3，4]。Ren 等[5]证实miR-483-5p 基因在乳腺肿瘤组织和正常乳腺组织中的表达存在差异，miR-483-5p 在正常组织中的表达水平较低，但是其与乳腺癌的关系以及是否可以作为乳腺癌发生发展的关键因子尚不清楚。基于此，本研究通过探讨乳腺癌组织中环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 表达特点，分析其临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2020年1月～2021年3月我院50 例乳腺癌患者的病理肿瘤样本作为实验组，配对的癌旁3cm 正常乳腺组织样本作为对照组。本研究经过我院伦理委员会批准，并在患者知情同意的情况下使用临床样本，记录患者生存情况以及临床病理学资料，包括患者的TNM 分期、肿瘤分化程度、年龄、肿瘤大小及淋巴结转移等，同时对患者进行术后随访。

纳入标准：①组织样本总长度超过1.5cm；②样本符合诊断标准和免疫处理，且不属于疑难病例；③所有样本均经病理学证实，患者术前未接受过任何治疗，且无其他恶性病史；④临床资料保存完整，收集的组织冻存于液氮中。排除标准：①样本来源患者不同意该实验措施且未签订知情同意书；②未经伦理委员会批准同意的样本。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 原位杂交检测试剂盒（MK1030，武汉博士德公司）；寡核苷酸探针稀释液（武汉博士德公司）；DEPC（Sigma 公司，美国）；DAB 显色试剂盒（北京中杉公司）。HT-1 组织芯片制备仪（辽宁恒泰公司）。环状RNA CDR1as 正向引物：5′-GAAA ATCCACATCTTCCAGACAA-3′，反向引物：5′-GAAG ACATGGATATTGAGCCAGT-3′。miR-483-5p 正向引物：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反向引物：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.2.2 组织芯片制备 采用定位仪对典型部位进行标记，并进行 HE 染色。在每个样品中选取3 个基因位点，利用HT-1 组织芯片制备机制造芯片，以1mm 为中心，以4μm 为基准，连续切片，然后进行HE 染色。

1.2.3 原位分子杂交 严格按原位杂交试验试剂盒中的说明书进行。具体操作步骤：将探针滴入薄片，按1:400 的比例，42℃恒温杂交16h。用37℃温水浴对抗体进行1h 的免疫反应，然后用 DAB 显色仪对其进行染色。将其与建立的阳性组织作对照，建立一个负对照：用探针稀释法代替探针。

1.3 观察指标①对所收集到的染色强度进行半定量的综合评价。阳性染色：乳腺上皮及细胞胞质均有显著的黄褐色。染色强度等级：弱或不带颜色为1 分，中度染色为2 分，强染色为3 分。阳性细胞计数：＜10%的细胞计数为1 分；10%～50%的细胞计数为2 分；＞50%的细胞计数为3 分。染色强度分数乘以阳性细胞计数分数为最终的统计分数，＞3分表示强阳性（高表达），1～3 分表示弱阳性（低表达）。②采用门诊、电话或微信的方式随访记录50例患者1年生存率及预后，患者死亡视为预后不良。

1.4 统计学方法数据采用SPSS 18.0 统计学软件分析，计量资料用±s描述，行t检验；计数资料用百分率描述，行χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier 分析，相关变量通过Logistic 回归方程分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 表达水平比较实验组环状RNA CDR1as 表达水平高于对照组，miR-483-5p 表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

1 两组环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 表达水平比较（±s）

1 两组环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 表达水平比较（±s）

分组n环状RNA CDR1asmiR-483-5p实验组501.24±0.522.31±0.41对照组500.70±0.534.37±0.48 t 5.14223.193 P 0.0000.000

2.2 影响环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌组织中表达水平的单因素分析饮食、体重和遗传对环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌组织中表达水平影响较小。肿瘤大小、TNM 分期和淋巴结转移是影响环状RNA CDR1as 及miR-483-5p在乳腺癌组织中表达水平的重要因素（P＜0.05），见表2。

表2 单因素分析

2.3 多因素分析多因素分析结果显示，肿瘤＞5cm、TNM 分期为Ⅲ期、淋巴结转移阳性是影响环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌组织中表达水平的重要因素（P＜0.05），见表3。

表3 多因素分析

2.4 乳腺癌患者1年生存率及预后50 例乳腺癌患者中RNA CDR1as 高表达、miR-483-5p 低表达共13例，死亡7 例，生存率为46.15%；两者均低表达37例，死亡5 例，生存率为86.49%；Kaplan-Meier 分析显示环状RNA CDR1as 高表达、miR-483-5p 低表达是患者预后不良的危险因素（Log Rank Cox=5.307，P=0.021）。

3 讨论

随着肿瘤分子技术的发展和临床经验的积累，乳腺癌的治疗手段也在不断改进，但更高水平的早期诊断及高危患者识别，是先进治疗手段发挥作用的前提。肿瘤的发生是由多个基因共同作用的，因此，利用分子生物技术可以为肿瘤的诊断和预测提供更好的方法，从而为肿瘤的治疗提供依据[6]。miR-483-5p 是一种内源性非编码RNA，其长度为22 个核苷酸，能直接切断目标mRNA，或与目标mRNA 的3′末端互补或不完全互补，从而阻断靶基因的mRNA 转录，在生命活动中起关键作用，甚至参与肿瘤的发生与发展[7]。环状RNA CDR1as 是一类非编码RNA，其作用机制主要是利用海绵对微小RNA 进行吸收。研究发现，环状RNA CDR1as 在很多实体肿瘤中均异常表达，而环状RNA CDR1as的异常表达可以调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移[8]。刘晓康等[9]研究发现，miR-483-5p 可通过调节肾上腺皮质癌下游的基因家族成员而抑制其侵袭性，表明miR-483-5p 可能是一种恶性肿瘤早期诊断和预后指标。有研究表明，miR-483-5p 以及环状RNA CDR1as 可作为一种新的肿瘤诊断及预后指标[10]，然而，miR-483-5p 以及环状RNA CDR1as 在乳腺癌发病过程中的作用机制尚不清楚。

本研究通过检测50 例乳腺癌患者的癌组织和50 例癌旁正常组织中环状RNA CDR1as 的表达，发现癌组织中环状RNA CDR1as 表达水平明显高于正常组织，miR-483-5p 表达水平低于正常组织，为进一步证实miR-483-5p 以及环状RNA CDR1as 在乳腺癌发生、发展过程中的作用提供了依据。张俊峰等[11]研究表明，miR-483-5p 基因的表达增加，对肿瘤细胞 EMT 有抑制作用，从而抑制了肿瘤细胞的浸润和转移。为进一步证实miR-483-5p 以及环状RNA CDR1as 在乳腺癌发生、发展过程中的作用，本研究分析了环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 表达水平与患者预后的相关性，结果显示环状RNA CDR1as 高表达及miR-483-5p 低表达的乳腺癌患者生存率低，环状RNA CDR1as 高表达、miR-483-5p 低表达是乳腺癌患者预后不良的危险因素（P＜0.05），分析其可能原因为：环状RNA CDR1as 的过度表达能促进肿瘤的生长，而CDR1as 的表达可以促进肿瘤细胞的凋亡。抑制环状RNA CDR1as对肿瘤细胞的浸润、转移有显著的抑制作用，并能促进其凋亡，进而影响患者肿瘤分级及淋巴结转移情况。Ulshöfer 等[12]研究也表明，环状RNA CDR1as 在癌组织中表达增高，并与肿瘤的大小、T分期、淋巴结转移和预后有关。此外，RNA 沉默引起的环状RNA CDR1as 高表达，可通过调节miR-7的表达，降低 REG-γ 基因的表达，增加了对抗药性乳腺癌的抗药性，进而影响患者预后。miR-483-5p 是一种具有潜在抑癌作用的miRNA，可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。Rahmati 等[13]利用在线生物信息技术对miR-483-5p 进行了初步探索，证实DAPK1 为miR-483-5p 的直接靶向靶点，通过miR-483-5p 靶向DAPK1 抑制DAPK1 作用，进而降低乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并证实miR-483-5p在乳腺癌患者中高表达与其预后相关。表明miR-483-5p 有望作为一种新的乳腺癌治疗生物目标，为乳腺癌患者提供新的疗法[14]。

本研究显示，环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 在乳腺癌组织中表达水平与肿瘤＞5cm、TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移阳性相关，但其具体影响机制有待于更多的研究证实。与正常乳腺组织比较，乳腺癌组织中环状RNA CDR1as 的表达升高。环状RNA CDR1as 基因的表达与其临床病理特点之间具有相关性。Belter 等[15]研究发现，环状RNA CDR1as 在癌组织中的表达水平明显增高，而环状RNA CDR1as 通过调节细胞基因，诱导其肿瘤细胞增殖分化，可能解释了环状RNA CDR1as 以及miR-483-5p 在乳腺癌组织中的表达水平与肿瘤＞5cm、TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移阳性间的关系。

综上所述，乳腺癌组织中RNA CDR1as 高表达及miR-483-5p 低表达与乳腺癌的不良预后相关，检测环状RNA CDR1as 及miR-483-5p 的表达水平，有利于诊断乳腺癌以及评估预后。