GeneXpert MTB/RIF检测在涂阴性肺结核诊断及耐药性检验中的应用

曹小九 李洪智 张晓琦

肺结核属于常见的呼吸系统传染性疾病，流行病学调查研究显示[1]，我国肺结核的发病率呈逐年上升趋势，且涂阴性肺结核占比高达85%，约13%的结核病传播由涂阴性肺结核所引起，故对涂阴性肺结核进行早期诊断在结核病防治工作中具有重要意义。目前临床上以抗酸染色和痰涂片作为涂阴性肺结核的主要诊断手段，但抗酸染色镜检方法的阳性检出率和敏感度较低，而痰涂片镜检操作复杂，且培养时间较长，均难以实现对涂阴性肺结核的及时诊断[2]。随着分子生物学技术的不断发展，GeneXpert MTB/RIF 技术可在2h 内直接检出是否含有结核分枝杆菌及该菌是否对利福平耐药，近年来被逐渐应用于结核病诊断中[3]。但目前临床上有关GeneXpert MTB/RIF 检测涂阴性肺结核以及利福平耐药性方面的报道较少，本研究对GeneXpert MTB/RIF检测在涂阴性肺结核诊断和耐药性检验中的应用价值做进一步分析。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2019年11月～2021年12月于我院就诊的120 例疑似涂阴性肺结核患者为研究对象。其中男78 例，女42 例，年龄21～85 岁，平均（53.17±7.97）岁。纳入标准：①出现咳嗽、咳痰、胸痛、乏力等肺结核典型临床症状；②经影像学检查，患者肺部有活动性肺结核病变。排除标准：①合并其他肺部疾病；②妊娠期或哺乳期女性。本研究已由我院医学伦理委员会批准，受试者均自愿参与研究，且签订相关同意书，患者家属获有知情权。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 患者入院后采集痰液3～5ml。若患者无法自然咳痰则对其采取雾化诱导措施进行排痰。取每份痰液标本的脓性部分做抗酸染色检查，剩余的痰液标本各取1ml 进行GeneXpert MTB/RIF检测和痰培养检测。

1.2.2 痰培养检测 在1ml 痰液中加入4%氢氧化钠1ml，震荡15～20s 后静置15～20min。采用无菌吸管将痰液标本接种到MGIT 79 培养基中。然后将其置入全自动结核培养药敏仪（型号：BACTEC MGIT960，厂家：Becton，Dickinson and Company）中。每周对培养结果进行报告和记录，若痰液标本为阳性，仪器的红色指示灯则会立即闪亮并出现提示音。

1.2.3 抗酸染色检测 应用齐-内染色法对抗酸杆菌涂片进行检测。结果判读标准：结核分枝杆菌阳性（4+）：每个视野发现＞9 条结核分枝杆菌；结核分枝杆菌阳性（3+）：每个视野发现1～9 条结核分枝杆菌；结核分枝杆菌阳性（2+）：100 个视野发现＞9 条结核分枝杆菌；结核分枝杆菌阳性（1+）：300 个视野发现＞9 条结核分枝杆菌；结核分枝杆菌阴性（-）：300 个视野发现1～8 条结核分枝杆菌。

1.2.4 药敏试验 依据《结核分枝杆菌药物敏感性试验标准化操作程序及质量保证手册》要求，将痰培养和抗酸染色中所有阳性标本接种至含有浓度为40μg/ml 利福平的罗氏培养基中进行药敏检测。在37℃环境下培养1 个月后对结果进行观察。

1.2.5 GeneXpert MTB/RIF 检测 采集患者痰液（1ml）后加入样本处理液（2ml）在试管中予以混合，然后震荡约30s，静置15min 左右。使用GeneXpert MTB/RIF检测专用的吸管将标本液体转移至专用的样本反应盒后整体放置于GeneXpert MTB/RIF 检测仪中，仪器开始自动化检测，约2h 后可直接读取结果。其中GeneXpert MTB/RIF 对结核分枝杆菌和利福平耐药的检测结果分别为结核分枝杆菌检出、结核分枝杆菌未检出和利福平耐药检出、利福平耐药未检出。

1.3 统计学分析应用SPSS 21.0 软件进行数据处理，计数资料以百分比表示，采用χ2检验，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三种检测方法检测涂阴性肺结核阳性率比较痰培养、抗酸染色、GeneXpert MTB/RIF 检测涂阴性肺结核阳性率依次为35.00%、32.50%、83.33%。与痰培养和抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 检测涂阴性肺结核阳性率较高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三种检测方法检测涂阴性肺结核阳性率比较（n）

2.2 三种检测方法对涂阴性肺结核诊断效能比较以临床最终诊断为“金标准”，其中临床最终诊断涂阴性肺结核101 例。与痰培养和抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 检测涂阴性肺结核的敏感度、特异性、准确度均较高，且与临床最终诊断的一致性最高，见表2。

表2 三种检测方法诊断效能比较

2.3 三种检测方法检测利福平耐药的效能比较以绝对浓度法药敏试验结果为“金标准”，其中绝对浓度法药敏试验鉴定利福平耐药16 例。痰培养、抗酸染色、GeneXpert MTB/RIF 检测利福平耐药的阳性率依次为26.73%、27.72%、23.76%，三者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。GeneXpert MTB/RIF 检测利福平耐药的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、准确度依次为87.50%、88.23%、58.33%、97.40%、88.11%，与痰培养和抗酸染色检测相比较，GeneXpert MTB/RIF 检测利福平耐药的效能更优，见表3。

表3 三种检测方法与绝对浓度法药敏试验结果比较

3 讨论

涂阴性肺结核具有较高的患病率和耐药率，若不采取有效措施，则会严重威胁公共卫生安全，故对涂阴性肺结核予以及时的诊断和耐药性的早期发现则显得尤为重要。抗酸染色涂片法和痰培养是临床上常用的结核病诊断方法，其中涂片法操作快速、简单，但敏感度较低，且对标本的菌量要求较高，具有一定的局限性；而痰培养耗时较长，增加了延误疾病诊断和治疗的风险[4]。

GeneXpert MTB/RIF 检测是近年来一种新型的检测方法，能在2h 内直接从痰液标本中检出是否含有结核分枝杆菌及该菌是否对利福平耐药。该检测方法主要通过巢式实时荧光定量PCR 法对结核分枝杆菌特有的序列rpoB 基因上与利福平耐药相关的核心区域（RRDR）进行检测，整合并自动进行样品纯化、核酸扩增、单一或复杂样品中的目标序列测定[5，6]。本研究结果显示，与痰培养和抗酸染色法相比，GeneXpert MTB/RIF 检测涂阴性肺结核阳性率明显较高。表明采用GeneXpert MTB/RIF检测在提高涂阴性肺结核诊断率、减少漏诊风险方面具有积极意义。此外，虽然涂阴性肺结核的传播性较弱，但是仍有约13%的结核病传播是由涂阴性肺结核造成的，故有效提高涂阴性肺结核患者阳性诊断率在结核病的早期诊断和防治工作中具有十分重要的意义[7，8]。此外，本研究结果还显示，以临床最终诊断为“金标准”，与痰培养、抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 检测涂阴性肺结核的敏感度、特异性、准确度均较高，且与临床最终诊断的一致性最高，提示GeneXpert MTB/RIF 检测对涂阴性肺结核的诊断效能较高。分析原因可能是因为抗酸染色涂片检测受操作方法等因素的影响，加之痰涂片的检出率和痰液标本的性状密切相关，需要每毫升痰液中至少有5000 拷贝抗酸杆菌才能检出阳性，故出现阳性检出率高低不一的情况较多[9，10]。痰培养耗时较长，一般至少需要6～8周，且可能有部分患者在诊断为涂阴性肺结核前服用过相关治疗药物，导致培养结果为阴性[11]。而GeneXpert MTB/RIF 检测则具有更高的敏感度和特异性，且在2h 内即可得到检测结果，因此与痰培养、抗酸染色相比，GeneXpert MTB/RIF 检测在涂阴性肺结核中具有更优的诊断效能和临床应用价值，可更好地对涂阴性肺结核患者进行辅助诊断。

利福平是目前临床上治疗肺结核的一线药物，但耐药性已成为肺结核传播控制不理想的主要原因[12]。耐药肺结核治愈率低、治疗费用高且时间较长，已成为结核病防治工作中的重点难题[13]。本研究结果显示，以绝对浓度法药敏试验结果为“金标准”，与痰培养和抗酸染色检测相比，GeneXpert MTB/RIF 检测利福平耐药的效能更优，与钟莉等[14]的研究相比，敏感度略低，考虑原因可能是不同地区菌株流行情况有所不同，利福平耐药中的rpoB基因突变比例存在一定的差异。值得注意的是，GeneXpert MTB/RIF 虽仅能对利福平进行检测，但有研究显示大部分对利福平耐药的肺结核患者对异烟肼也耐药。GeneXpert MTB/RIF 在利福平耐药的早期检测中具有积极意义，同时也可作为耐药肺结核的诊断方式[15]。

综上所述，GeneXpert MTB/RIF 检测涂阴性肺结核的敏感度、特异性、准确度均较高，具有良好的诊断效能，同时在筛查利福平耐药方面也具有较高的临床应用价值，值得推广和应用。