大鼠腰椎间盘突出中交感神经分支作用的研究

李庆伟 齐豹 高龙飞

腰痛是临床常见症状，50%～80%的人患有腰痛，15%的人可能患有慢性腰痛[1]。因腰痛就诊的患者例数仅次于上呼吸道感染[2]。关于腰痛的发病机制尚未达成共识，最常见的原因是腰椎间盘退行性病变，这是一个复杂的生理过程，受环境、年龄、遗传、动力学和其他许多因素的影响[3～5]。近年来，一些学者提出了一种新的椎间盘源性腰痛的概念，用于描述由于腰椎间盘内部成分及结构的病理性变化而引起的腰痛[6]。约40%的慢性腰痛患者患有椎间盘源性腰痛[7]。

目前，临床对于椎间盘源性腰痛的发病机制认识不足。在患有椎间盘源性腰痛的患者中，椎间盘的纤维环通常伴有病理间隙。由于各种炎症介质的作用，椎间盘的结构在上述生长和修复过程中会发生病理变化，从而导致腰痛[8，9]。Peng 等[10]的磁共振成像研究显示，椎间盘源性腰痛患者的腰椎间盘高信号区基本均为纤维环裂隙内的炎性肉芽组织。交感神经在上述传导途径中起重要作用[11]。椎间盘后部的纤维环内以交感神经和脊神经为主，疼痛信息由交感神经介导[12]。因此，研究椎间盘源性腰痛的传导途径具有重要意义。

目前大多数关于椎间盘源性腰痛的研究主要集中在动物模型的交感神经干上。然而，交感神经干离断对动物的腹部脏器和下肢功能有着较大影响[13]。因此在本研究中，使用荧光金（FG）逆行追踪，采用物质P（SP）进行免疫组织化学（IHC）实验来研究其机制，实验中最大程度保护大鼠的神经功能。本实验在分离L5～6椎间盘的L2和L5交感神经分支后，研究疼痛信息的传导途径，以此研究椎间盘源性腰痛的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物选择120 只体重为260～320g 的纯种近交SD 大鼠，饲养在通风良好、室内湿度为51%～56%、温度为20℃～25℃的清洁环境中，大鼠可以自由获取食物和水。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 分组和准备将120 只SD 大鼠分为椎间盘前部组（A 组，n=60）和椎间盘后部组（B 组，n=60）,A 组为椎间盘前部药物注射并切断不同交感神经；B 组为椎间盘后部药物注射并切断不同交感神经。再根据交感神经分支切断部位将A 组分为A0、A-L2、A-L5、A-L2-L5组，各15 只大鼠；将B 组分为B0、B-L2、B-L5、B-L2-L5组，各15 只大鼠。

以40mg/kg 的剂量给予大鼠腹膜内注射3%戊巴比妥，并在麻醉后将其四肢固定至仰卧位，无菌条件下切开腹部，切口直径约5cm，纵向切开腹膜使其横向分离，并完全暴露交感神经干与其交通分支相交的部位。A0 组和B0 组不切断椎间盘的交感神经分支，A-L2组切断椎间盘前部的L2交感神经分支，A-L5组切断椎间盘前部的L5交感神经分支，A-L2-L5组同时切断椎间盘前部的L2和L5交感神经分支。同样，B-L2组切断椎间盘后部的L2交感神经分支，B-L5组切断椎间盘后部的L5交感神经分支，B-L2-L5组同时切断椎间盘后部的L2和L5交感神经分支。

1.3 FG 注射和治疗处理将FG（购自奥特沃生物技术有限公司）注射到大鼠L5～6椎间盘的前后部。首先仔细处理L5～6椎间盘连通分支，缝合切口，然后将大鼠置于俯卧位。在大鼠背部行以L5～6椎间隙为中心的5cm 纵向切口。剥离椎旁肌，取出L5和L6椎板的上边界，露出内鞘，将内鞘移出对侧中线。然后使用含有0.2μl 的10%FG 注射器在纤维环处穿刺至1mm 深度，在10min 内缓慢注射溶液，并用氰基丙烯酸酯粘合剂封闭针孔以避免FG漏出。在FG 已注射至椎间盘后，用手术线缝合切口。手术后4 天内给予大鼠注射青霉素预防感染，剂量为2 000 000U/ml。手术后7 天对大鼠实施安乐死。移除T13～L6区段的前后背侧神经节（DRG），并且移除L5～6椎间盘软组织。固定DRG 和椎间盘软组织，并将其浸入蔗糖-PBS（20%）溶液中过夜。

1.4 免疫组化分析将DRG 洗涤包埋，制成40μm厚的长轴位DRG 切片。切片放于0.1%Triton X-100 溶液中孵育20min。将切片在1:50 稀释的兔抗大鼠SP 血清（由中国上海Abcam Trading Co.，Ltd 提供）中孵育72h。然后将切片在1:100 稀释的山羊抗兔二抗中孵育60min。之后用PBS 洗涤样品并固定在载玻片上。最后盖上载玻片密封。

1.5 筛选和细胞计数处理好的L5～6椎间盘使用XSP-63X 三目荧光显微镜观察FG 在注射部位周围的渗透。在椎间盘周围组织中观察到FG 从纤维环中渗出，并扩散到髓核的中央区域。荧光显微镜检查显示FG 阳性细胞有金黄色细胞质，SP 阳性细胞有鲜红色细胞质。在相同位置研究多个载玻片并计数FG 和SP 双标记阳性的细胞数。

1.6 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组内比较采用t检验，组间比较采用单因素方差分析。计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较A-L2组2 只大鼠FG注射失败，符合率为86.67%（13/15）。A-L5组1只大鼠FG 注射失败，符合率为93.33%（14/15）；A-L2-L5组4 只大鼠FG 注射失败，符合率为73.33%（11/15）。B-L2组和B-L5组各2 只大鼠FG 注射失败，符合率均为86.67%（13/15）。B-L2-L5组3 只大鼠FG 注射失败，符合率为80.00%（12/15）。各组大鼠性别、周龄及体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠一般情况比较[n（%）]

2.2 A 组大鼠椎间盘各部位DRG 细胞数量比较在大鼠L5～6椎间盘L2和L5交感神经分支离断前后，A-L2组和A-L2-L5组L2区段中带有双标记的DRG 细胞数量显著少于A0 组（t=5.173，P＜0.001；t=5.293，P＜0.001）。在其他区段中，不同组之间带有双标记的DRG 细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）。A-L2组和A-L2-L5组中，L2区段及其他区段中带有双标记的DRG 细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）。在A-L5组与A0 组中，T13、L1、L2、L3、L4、L5及L6区段内带有双标记的DRG 细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 A 组大鼠L5～6 椎间盘中L2 和/或L5 交感神经分支切断前后带有双标记的DRG 细胞数量（±s）

表2 A 组大鼠L5～6 椎间盘中L2 和/或L5 交感神经分支切断前后带有双标记的DRG 细胞数量（±s）

注：与A0 组比较，*P＜0.01

组别nT13L1L2L3L4L5L6 A0 组154.1±2.814.8±4.819.4±4.16.4±2.55.4±3.12.8±1.24.3±1.8 A-L2 组134.2±2.014.5±3.911.8±3.6*5.9±2.85.2±3.22.5±1.34.1±2.0 A-L5 组143.8±2.413.9±5.118.9±5.16.3±3.04.8±2.52.9±0.93.5±2.3 A-L2-L5 组 113.5±1.912.4±4.210.7±4.6*5.8±3.14.5±2.13.0±1.43.7±1.9 F 0.2210.65914.2500.1400.2650.4040.460 P 0.8800.581＜0.0010.9350.8490.7500.711

2.3 B 组大鼠椎间盘各部位DRG 细胞数量比较在大鼠L5～6椎间盘L2和L5交感神经分支离断前后，与B0 组相比，B-L2组在L2区段中具有明显更少的带有双标记的DRG 细胞数量（t=5.561，P＜0.001），B-L5组在T13、L1和L2区段中具有明显更少的带有双标记的DRG 细胞数量（t=2.425，P=0.022；t=2.902，P=0.007；t=4.720，P＜0.001），B-L2-L5组在T13、L1和L2区段中具有明显更少的带有双标记的DRG 细胞数量（t=3.472，P=0.001；t=4.613，P＜0.001；t=10.150，P＜0.001）。在其他区段中，不同组别之间带有双标记的DRG 细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05）。B-L2-L5组L2区段中带有双标记的DRG 细胞数量明显少于B-L2组和B-L5组（t=4.627，P＜0.001；t=5.229，P＜0.001）。在B-L2组和B-L5组中，T13、L1、L2、L3、L4、L5及L6区段带有双标记的DRG 细胞数量差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 B 组大鼠L5～6 椎间盘中L2 和/或L5 交感神经分支切断前后带有双标记的DRG 细胞数量（±s）

表3 B 组大鼠L5～6 椎间盘中L2 和/或L5 交感神经分支切断前后带有双标记的DRG 细胞数量（±s）

注：与B0 组比较，*P＜0.01；与B-L2 组和B-L5 组比较，#P＜0.01

组别nT13L1L2L3L4L5L6 B0 组158.3±3.415.8±5.119.4±4.612.6±3.811.2±2.7 8.9±3.4 4.2±2.7 B-L2 组137.8±2.813.7±4.510.7±3.5*11.4±4.89.3±5.47.8±3.1 3.8±2.5 B-L5 组135.3±3.1*10.8±3.8*11.8±3.8*11.7±5.110.3±3.8 9.0±4.6 4.1±3.2 B-L2-L5 组124.4±2.1*8.5±3.4*5.3±2.1*#8.9±4.29.9±3.47.7±3.4 3.6±1.4 F 6.2597.40033.9001.6010.5800.4700.151 P 0.001＜0.001＜0.0010.2010.6300.7040.928

3 讨论

下背部疼痛主要是由于椎间盘内部结构的变化所致。腰椎间盘纤维环的外层中含有大量纤维，且分布在整个外周纤维环中[9]。其有两种类型的疼痛传递纤维：有髓鞘的Aδ 纤维和无髓鞘的C纤维[14]。椎间盘在纤维环破裂或损伤后会发生炎症反应，这些反应可能涉及多种炎症介质和炎症细胞。由于椎间盘髓核中的内部疼痛感受器和纤维环周围组织中神经末梢的刺激，触发了不同程度的下背部疼痛[15，16]。正常椎间盘中的SP 免疫阳性神经纤维可存在于纤维环外层，但在退行性病变的髓核和椎间盘中，也能观察到SP 免疫阳性的疼痛神经纤维[17]。机械或化学物质刺激伤害感受器或疼痛感受器可引发腰痛[18]。发生病理变化的腰椎间盘疼痛信息是由腰椎窦椎神经至相应的DRG 传导的，其中相应的神经元节段占主导作用[19]。然而，椎间盘源性腰痛并不是沿着其周围组织的主导区域分布，而是表现为弥散性背痛，固定的压痛点较少，难以定位[20]。腰部皮肤和下腰部受臀上皮神经支配，这些神经是L1～3段中皮神经的后分支。相反，没有皮神经在S1和L5节段的后分支区域中分布。因此，腰椎间盘病变引起的腰痛只能用L1和L2段中引起疼痛来解释，而不是S1和L5段的放射性疼痛[21]。生殖道神经是L2区段中DRG 的分支之一，主要传递来自腹股沟区域皮肤的疼痛信息。因此，很难解释神经根神经节段区域的具体主导[22]。

本研究采用FG 逆行追踪和SP 免疫组织化学相结合的方法，研究大鼠L5～6椎间盘的疼痛信息通路。FG 具有高灵敏度，可用于标记细胞质个数，是使用最广泛的中性逆行示踪剂。FG 不仅可以标记传递疼痛的细胞和神经纤维，还可以标记非疼痛细胞和纤维神经[23]。SP 是参与疼痛信息传递的神经肽。腰椎间盘中具有鲜红色细胞质的SP 阳性细胞代表DRG 神经元[24]。将大鼠L5～6椎间盘中切断L5交感神经分支后，在A-L5组和A0 组之间任何区段中带有双标记的DRG 细胞数量均无显著差异。这表明L5交感神经分支不参与大鼠L5～6椎间盘的神经传导通路。在大鼠L5～6椎间盘中切断L2交感神经分支后，A-L2组和A-L2-L5组在L2区段中带有双标记的DRG 细胞数量明显少于A0 组。A-L2组和A-L2-L5组在L2区段中带有双标记的DRG 细胞数量无显著差异。此外，仅离断L2交感神经分支与同时切断L2和L5交感神经分支后的功能相似。在大鼠中，L5～6椎间盘中的疼痛信息传导过程不涉及相同节段中的L5交感神经分支或DRG。在L5～6椎间盘中切断L5交感神经分支后，与B0 组相比，B-L5组T13、L1和L2区段中带有双标记的DRG 细胞数量显著减少。此外，两组之间其他区段带有双标记的DRG 细胞数量无显著差异。这表明椎间盘中的疼痛信息通过两条不同的通路传导到上下腰椎DRG。L5交感神经分支参与上腰椎DRG 的传导通路，而与下腰椎DRG 的传导通路无关。在L5～6椎间盘中切断L2交感神经分支后，与B0 组相比，B-L2组中带有双标记的DRG 细胞数量仅在L2区段中显著减少。同时切断L2和L5交感神经分支，B-L2-L5组L2区段中带有双标记的DRG 细胞数量显著少于B-L2组和B-L5组。这表明L2和L5交感神经分支均参与并影响从L5～6椎间盘到L2DRG 疼痛信息的传导，L2和L5交感神经分支在大鼠L5～6椎间盘的神经传导通路中起到了不同作用。Suseki 等[25]报道了腰椎间盘中存在交感神经纤维和受体神经纤维的分布。腰椎间盘中的感觉神经沿窦椎神经进入交感神经分支，但不进入脊神经的同一节段。因此，L2和L5交感神经分支在大鼠L5～6椎间盘的疼痛信息传导通路中起到了不同作用。

本研究中动物实验具有可重复性，不同组别大鼠的性别、年龄及体质量无差异，确保了本研究的可靠性。但本研究仍存在一些不足之处：首先，在刺穿大鼠椎间盘时难以评估注射器刺入的深度，这可能导致同一区段中带有双标记的DRG 细胞数量的差异。其次，疼痛神经传导途径在大鼠和人之间不同，本研究并未揭示人类椎间盘源性腰痛的过程。再者，本实验使用正常大鼠进行研究，因此无法研究可能发生在椎间盘源性腰痛发生发展过程中的特定机制。因此，在未来的研究中，应在具有病理性椎间盘源性腰痛患者中研究疼痛感知传导途径，以进一步验证本研究的结论。

总之，L2和L5交感神经分支在大鼠L5～6椎间盘前部的疼痛信息传导中起到了不同的作用。L2交感神经分支参与从L5～6椎间盘到L2DRG 的疼痛信息通路过程，而L5～6椎间盘的疼痛信息则通过两条不同的通路传导至上下腰椎DRG。L5交感神经分支参与从L5～6椎间盘向上腰椎的传导通路过程，与L5～6椎间盘至下腰椎的传导通路过程无关。