IL-17A三个多态性位点与泉州地区人群类风湿关节炎相关性研究

王清瑶 郑晨娜 杨会勇 饶华春

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种以对称性、破坏性关节病变为特征的慢性全身性自身免疫性疾病[1]，在我国的发病率为0.32%～0.36%，在全球的发病率为0.5%～1.0%[2]。RA 因环境因素诱导或加剧病症，患者关节多呈现对称性、破坏性的病变。在相同的环境背景下，部分人群的RA 易感性显著增强，这与个体RA 相关基因的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）密切相关[3]。遗传差异导致了个体差异及个体产生的免疫反应不同，遗传差异更好地解释了不同个体疾病的易感性和流行病学的不同。

白介素-17（Interleukin-17，IL-17）是由Th17细胞分泌的一种致炎因子，能够诱导多种炎症因子和炎症趋化因子的表达，在骨的侵蚀破坏过程中起重要作用[4]。IL-17A 基因位于第6 号染色体上，长度4 252bp，其SNP 位点均位于非编码区，其中人类非同义SNP 有9 个。IL-17A/F 基因多态性与多种炎症反应和自身免疫性疾病相关[5]。因此，本研究根据 rs3819024A/G、rs3819025G/A 和rs4711998A/G 基因多态性分析，统计泉州地区人群的遗传学数据，以便深入探讨泉州地区人群RA 的发病特征、机制、基因遗传背景和分子生物学基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料本研究采用病例-对照研究法。207 例患者为泉州市正骨医院已确诊的RA 患者，达到ACR2010 RA 分类标准[6]。排除标准：合并其他自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病者；有严重肝病或肾功能障碍或心功能不全者；孕妇及哺乳期者；使用生物制剂、非甾体抗炎药、糖皮质激素、免疫抑制剂或中药治疗者。252 名健康对照者为体检的健康志愿者，无遗传疾病和传染性疾病。本研究通过泉州市正骨医院伦理委员会批准，所有受试者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血采集 采集研究对象外周血于EDTA抗凝管中，随后分装保存于-20℃冰箱。

1.2.2 引物设计 从NCBI 网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）获取SNP 位点附近序列各250bp 左右。使用Primer 5.0 软件设计一条正向公共引物和2 条分别与SNP 位点互补的特异性反向引物，其中3′端第三个碱基人为引入一个错配碱基[7]。

1.2.3 全血三引物扩增法[8]采用本课题组建立的三引物等位基因特异性PCR 扩增法进行目的基因的SNP 分型检测。15μl 扩增体系如下：0.2μl 5U/μl Taq DNA 聚合酶（TaKaRa，大连），2μl 2.5mM dNTP，通用引物和特异性引物各0.5μl，1.5μl 10×Buffer（含Mg2+），2μl 50% 甘油，3μl 5דYW”缓冲液（本实验室自行研制），最后加入无菌水4.9μl。体系震荡混匀，离心后静止垂直加入外周血模板0.4μl。PCR 循环参数：96℃预变性3min；95℃变性20s，55℃复性20s，72℃延伸20s，循环35 次；72℃延伸5min，4℃保存。扩增反应结束后，取产物5μl 加入2%的琼脂糖凝胶孔（ExRed 核酸染料染色），100V 电泳15min。紫外线凝胶成像系统显像，根据条带的位置和数目进行基因型分析。

1.3 统计学方法采用SPSS 25.0 统计软件，等位基因及基因型频率用基因计数法统计。基因型的Hardy-Weinberg 平衡符合程度采用χ2检验。组间基因型和等位基因频率采用χ2检验或Fisher 精确概率法，非条件Logistic 回归模型分析不同基因型与RA发生的关系，计算比值比（oddsratio，OR）及其95%可信区间（95%CI），以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象特征分析及SNP 位点Hardy-Weinberg平衡检验252 名健康对照者中女108 例（42.86%），男144 例（57.14%）；年龄10～88 岁，平均（47.1±10.4）岁；随机抽取门诊或住院的属于福建泉州地区汉族RA 患者207 例，年龄15～78 岁，平均（55.23±11.28）岁；其中女151 例（72.91%），男56 例（27.09%）。两组患者性别、年龄比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且RA 患者中女性所占比例远大于男性，与国内RA流行病学调查相符合。两组3 个SNP 位点的分布频率Hardy-Weinberg 平衡检验均P＞0.05，符合随机性抽样原则，具有较好的群体代表性（见表1）。

表1 Hardy-Weinberg 检测结果（P 值）

2.2 基因型和等位基因频率分布比较rs3819024位点的AA、AG、GG 基因型在两组的分布频率比较，差异无统计学意义（P=0.683），等位基因A 型和G 型在两组间患病风险比较，其OR值为1.078，95%CI为0.831～1.399，P=0.570。

rs3819025 位点的AA、GA、GG 基因型在两组的分布频率比较，差异无统计学意义（P=0.090）；与携带GG 纯合基因型的研究对象相比，携带GA 或者AA+GA 基因型者患RA 风险较高。等位基因A 型和G 型在两组间患病风险比较，其OR值为1.437，95%CI为1.014～1.037，P=0.041。

rs4711998 位点的AA、AG、GG 基因型在两组间比较差异无统计学意义（P=0.713），等位基因A 型和G 型在两组间患病风险比较，其OR值为0.926，95%CI为0.690～1.242，P=0.608。见表2。

表2 两组基因型和等位基因频率分布比较

3 讨论

RA 是一种慢性、关节对称受累的炎症性自身免疫性疾病，表现为关节内滑膜增生、骨和软骨不可逆损伤[9]。在RA 发病发展的炎症信号通路中，IL-17 因子可以促进血管生成、骨损伤和加速自身免疫性进程[10]。研究表明，克隆小鼠IL-17A 的cDNA序列激活后，分泌蛋白于胞外，导致NF-κB 和PB-激酶途径激活，继而诱导溶液纤维细胞分泌IL-6、IL-8 因子，进一步刺激T 细胞增殖[11]。

近年来，研究发现IL-17A 基因上的多个SNP位点与哮喘、RA、炎症性肠炎和溃疡性结肠炎等多种免疫性疾病显著相关[12～17]。为此本研究根据文献资料分析IL-17A 基因上3 个SNP 位点（rs3819024 A/G、rs3819025G/A 和rs4711998A/G）[18～25]与泉州地区人群RA 患病风险的相关性，结果发现其中rs3819025 A等位基因会增加RA 患病风险。

Chen 等[26]选取615 例RA 患者和839 名健康对照者为研究对象，研究IL-17A（rs3819024A/G、rs3819025G/A 和rs4711998A/G）基因多态性在当地人群中与RA 易感性的关联，结果显示rs3819025位点的A 等位基因会增加RA 患病风险（GA vs.GG：OR=1.29 [95%CI（1.02～1.63），P=0.036]；GG vs.AA+GA：OR=1.29 [95%CI（1.02～1.61），P=0.030]，与本研究结果一致。通过基因统计分析得出，IL-17A rs3819025G/A基因多态性与福建泉州地区RA 人群的易感性有一定关联，其中携带AA 基因的人群可能属于发病风险较高人群。基因多态性SNP 作为人群、地域的一种分子标志[27]，是遗传变异中常见的一种，除了与种族、地域相关外，还与生活环境、饮食、生活方式、气候等因素相关[28]。近年来，随着基因测序等技术的快速发展，发现不同的遗传背景导致群体疾病易感性、预后质量和药物反应不同。因此研究IL-17A（rs3819024A/G、rs3819025G/A 和rs4711998A/G）基因多态性，不仅为RA 的相关发病机制研究以及防治提供科学有效的途径，还为群体遗传学和人类学的研究提供理论基础[29]。同时，本研究也存在不足，一是样本量较少，二是未与临床生化指标相联系，三是未与其他地区人群进行分析比较，结果仅具有区域代表性，如何深入分析IL-17A 基因多态性在不同民族、种族人群中对疾病的影响，是今后研究的方向。