复方乙醇手消毒液中连翘质量标准研究*

郭 娅，向春艳△，何世新，杜 彪

（1.重庆市万州食品药品检验所·三峡库区道地药材开发利用重庆市重点实验室，重庆 404000；2.重庆大学附属三峡医院，重庆 404000）

复方乙醇手消毒液由重庆大学附属三峡医院开发，主要药物连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果实，有清热解毒、消肿散结、疏散风热功效[1］，《本草图经》誉其为“疮家圣药”[2］。现代药理学研究表明，连翘具有抑菌、抗炎、抗病毒、保肝、抗肿瘤、免疫调节和抗氧化作用[3］。近年来，国家卫生管理部门推荐以其配伍的多种中成药预防新型冠状病毒感染[4-5］，有一定疗效。王小敏等[6］的研究结果表明，连翘果乙醇提取物抑菌活性与其中含有的多种醇类、酚类、醛类、酮类、烷烃、烯烃类物质相关，且45%～90%乙醇溶液也有抑菌作用[7］，二者联用能进一步增强抑菌消毒作用，故可用于疫情防控期间的日常消毒。2020年版《中国药典（一部）》中连翘含量测定项下包含连翘苷和连翘酯苷A，为快速、方便、有效地测定两种成分含量，多采用高效液相色谱（HPLC）法、超高效液相色谱（UPLC）法及一测多评等法[8-11］。为进一步完善质量标准，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对制剂中连翘药材进行定性鉴别，并采用HPLC法同时测定制剂中连翘酯苷A和连翘苷含量，以建立复方乙醇手消毒液中连翘的质量标准。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，含紫外检测器（美国Agilent公司）；GC-2010plus型气相色谱仪（日本Shimadzu公司，内含FID）；AB204S型分析天平（瑞士Mettler公司，精度为万分之一）；ME215S型分析天平（德国Sartorius公司，精度为十万分之一）；KQ-800DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

连翘酯苷A对照品（批号为111810-201606，含量93.4%）、连翘苷对照品（批号为110821-201816，含量95.1%）、连翘对照药材（批号为120908-201817），均购自中国食品药品检定研究院；复方乙醇手消毒液（重庆大学附属三峡医院，批号分别为211013，211018，211020）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）。

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

肉眼观察，样品为棕色液体；嗅之，微臭；pH试纸检测得pH为4.5～6.0。

2.2 TLC鉴别

取样品5 mL，水浴浓缩至干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取连翘对照药材1 g，加石油醚（30～60℃）20 mL，密塞，超声（功率800 W，频率40 kHz）处理15 min，滤过，滤液浓缩至干，残渣加乙醇2 mL，作为对照药材溶液。按复方乙醇手消毒液处方和工艺制备缺连翘的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。按2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法试验，吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸（15∶10∶0.25，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光灯及紫外光灯（365 nm）下检视[1］。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色斑点，阴性对照无干扰，详见图1。

图1 连翘薄层色谱图A.Fluorescent lamp B.Ultraviolet lamp 1.Test solution 2.Reference medicinal material solution 3.Negative reference solutionFig.1 TLC chromatograms of Forsythiae Fructus

2.3 乙醇体积分数检查

精密量取无水乙醇适量，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀释，制成每1 mL中含乙醇8 mg的对照品溶液。另精密量取样品适量，同法操作，得供试品溶液。精密量取上述溶液各1μL，分别注入气相色谱仪，按2020年版《中国药典（四部）》通则0711乙醇量测定法，色谱柱为HR-5毛细血管柱（30 m×0.32 mm，0.25μm），载气为氮气，流速为1.0 mL/min，进样量1μL，分流比50∶1，进样口温度150℃，检测器温度230℃；柱温先在50℃维持5 min，再以20℃/min的升温速率升至150℃，维持3 min，依法进行测定，按相关规定进行精密度、稳定性、重复性试验。结果的RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好，对照品溶液、供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定，方法重复性良好。按外标法计算峰面积，结果批号为2011013，2011018，2011020的复方乙醇手消毒液中乙醇体积分数分别为56.2%，55.8%，56.3%（均不少于50%），符合标准。详见图2。

图2 气相色谱图1.Ethanol A.Reference solution B.Test solutionFig.2 GC chromatograms

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱：中谱红RD-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min时85%A，10～22 min时85%A→77%A；22～33 min时77%A→60%A，33～39 min时60%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

2.4.2 溶液制备

取连翘酯苷A、连翘苷对照品各适量，精密称定，加50%甲醇，制得含连翘酯苷A 0.391 5 mg/mL、连翘苷0.202 4 mg/mL的单一对照品贮备液；分别精密量取上述连翘酯苷A对照品贮备液3.0 mL、连翘苷对照品贮备液1.2 mL，置同一10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，即得混合对照品溶液。精密量取样品1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。按复方乙醇手消毒液处方和工艺制备缺连翘的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.4.3 方法学考察

专属性试验：取2.4.2项下3种溶液，按2.4.1项下色谱条件进样测定。结果2种被测成分分离完全，且阴性对照无干扰，表明专属性良好。详见图3。

图3 高效液相色谱图1.Forsythoside A 2.Forsythin A.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.4.2项下连翘酯苷A对照品贮备液0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，5.00 mL；连翘苷对照品贮备液0.10，0.20，0.40，0.80，1.20，2.00 mL，分别置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，制得系列混合对照溶液。按拟订色谱条件进样测定，以质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，连翘酯苷A为Y1=10.635 74X1+3.492 08（r=0.999 9），连翘苷为Y2=11.979 04X2-2.958 86（r=0.999 8）。结果表明，连翘酯苷A和连翘苷质量浓度分别在9.79～195.75μg/mL和2.02～40.48μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取混合对照品溶液，按2.4.1项下色谱条件重复进样测定6次，记录峰面积。结果连翘酯苷A、连翘苷峰面积的RSD分别为0.11%和0.29%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为211013），按2.4.2项下方法制备供试品溶液，分别在室温下放置0，2，4，8，12，24 h时，按2.4.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果连翘酯苷A、连翘苷峰面积的RSD分别为0.35%和0.68%（n=6），表明供试品溶液室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批样品（批号为211013），按2.4.2项下方法制备供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件进样测定，平行6次，记录峰面积并计算含量。结果连翘酯苷A、连翘苷含量的RSD分别为0.11%和0.27%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的样品（批号为211013）6份，每份0.5 mL，分别精密加入连翘酯苷A（0.392 mg/mL）1.0 mL、连翘苷（0.202 mg/mL）0.5 mL，按2.4.2项下方法制备供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4.4 样品含量测定

取3批样品各1.0 mL，按2.4.2项下方法制备供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果批号为211013，211018，211020的样品中，连翘酯苷A含量分别为1.580，1.557，1.572mg/mL，连翘苷分别为0.166，0.164，0.165mg/mL。

3 讨论

由于连翘酯苷不稳定，高温下易分解，有研究表明，提取溶剂的种类和浓度在连翘酯苷A和连翘苷提取工艺研究中影响较大[12-14］，故最终选择甲醇提取。GUO等[14］及王姝君等[11］分别选用50%及70%甲醇为溶剂，结果选择50%甲醇时，目标成分提取率较高、干扰峰少、分离度较高，且方法简单，成本低。同时对比文献[15-16］，参考不同方法，比较了检测波长分别为235，275，330 nm时的结果；考察了0.1%磷酸溶液-乙腈、水-乙腈、0.4%醋酸-乙腈流动相体系；研究了0.1%，0.2%，0.4%磷酸溶液对结果的影响。结果表明，当检测波长为235 nm，流动相为0.1%磷酸溶液-乙腈（梯度洗脱）时，色谱峰的峰形和分离度最佳。

本研究中建立的复方乙醇手消毒液质量标准结果准确可靠，配制简单、易得、价格低，是一种可灭活病毒，杀灭肠道致病菌、化脓性球菌、致病性酵母菌及医院感染常见细菌的速效消毒液。但本研究也存在一定局限性，虽然按2020年版《中国药典（一部）》中连翘药材的规定对连翘苷、连翘酯苷A进行了含量测定[1］，但连翘中含有的化学成分复杂，如绿原酸、咖啡酸、没食子酸、阿魏酸等[17］，因此其余成分的质量标准有待进一步提升。