基于蛋白酶活力的地龙酒制工艺优选*

周广涛，黄蒙蒙，解盈盈，汪 冰，林永强△

（1.山东省食品药品检验研究院·国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室·山东省中药标准创新与质量评价工程实验室，山东 济南 250101；2.山东宏济堂制药集团股份有限公司，山东 济南 250000）

地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）、通俗环毛蚓Pheretima vulgarisChen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或栉盲环毛蚓PheretimapectiniferaMichaelsen的干燥体（前1种习称“广地龙”，后3种习称“沪地龙”）[1］。地龙广泛应用于各类溶栓制剂，但因腥味较浓，常通过炮制（最常使用酒制）祛臭矫味[2］。目前，酒地龙多收载于各省（区、市）地方标准中，但其标准较简单，无法有效控制饮片的质量。有研究表明，地龙中抗栓主要活性成分为蚯蚓纤溶酶[3-10］，过度受热和加入过量乙醇可能影响酶活力，进而影响饮片的药效。因此，可通过测定酶活力，对炮制条件、工艺参数加以控制，以祛臭矫味且保证药效。本研究中采用水提法[11］提取蚯蚓纤溶酶，L9（34）正交试验法对加酒量、炮制温度、炮制时间和焖润时间4个影响因素进行考察，并采用纤维蛋白平板法[12-13］测定酒制品的酶活力，确定最优炮制工艺。现报道如下。

1 材料

1.1 仪器与试药

仪器：Sartorius CP225D型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；Climacell222型恒温恒湿箱（德国MMM集团）；玻璃培养皿（定制，10 cm×10 cm）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；V14r pro型台式高速离心机（生命动力亚洲Dynamica有限公司）。

试药：纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原、凝血酶（均来自牛血，中国食品药品检定研究院，批号分别为140607-202042，140606-201826，140605-201927）；磷酸二氢钠、氯化钠、盐酸（国药集团化学试剂有限公司，批号分别为20190415，20180111，20190729）；黄酒（浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，批号为20211006）；水为纯化水。地龙（市场购买），经我院汪冰副主任药师鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）的干燥体。

2 方法与结果

2.1 纤维蛋白板制备

取琼脂糖100 mg，加磷酸盐缓冲液（PBS；取磷酸氢二钠21.4 g，氯化钠5.26 g，加水900 mL，用1 mol/L盐酸调pH至7.8，再加水至1 000 mL，即得；下同）8 mL，加热使溶解，制成琼脂糖溶液，置55℃水浴中恒温待用。分别取纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原、凝血酶加PBS制成每毫升分别含3.5，1，10个单位的溶液，分别精密量取6，1，1 mL，依次加入上述琼脂糖溶液中，混匀，迅速倒入水平放置的培养皿中，待其凝固后，盖上盖，于4℃保存1 h，取出，在纤维蛋白凝固层上打若干个直径约3 mm小孔，即得纤维蛋白板。

2.2 酶活力计算

以单位质量样品溶圈面积计算蚯蚓纤溶酶活力[14］。公式如下：总活力=(π×r2)/(G×V)×定容体积，式中，r为溶圈半径（mm），G为取样量（g），V为点样量（mL）。

2.3 水提条件考察

提取方式：取药材样品粉末（过3号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水25 mL，称定质量。分别以超声（功率250 W，频率50 kHz）处理3 h、静置提取16 h、振荡（频率120 r/min，下同）提取16 h。取出，放冷，再次称定质量，用水补足减失的质量，6 000 r/min离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。各精密量取10μL，注入纤维蛋白板孔中，37℃恒温保持18 h后，测量溶圈半径。结果，超声法提取时无溶圈；恒温振荡和静置提取时的溶圈半径分别为4 mm和2.5 mm。故确定以振荡提取。

提取温度：同“提取方式”项下方法处理药材样品，加水，称定质量。分别置30℃、40℃、50℃恒温振荡提取16 h。取出，放冷，再次称定质量，用水补足减失的质量，6 000 r/min离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。各精密量取10μL，注入纤维蛋白板孔中，37℃恒温保持18 h后，测量溶圈半径。结果，30℃、40℃、50℃提取时的溶圈半径分别为2.5 mm、4 mm和3 mm。故确定提取温度为40℃。

提取时间：同“提取方式”项下方法处理药材样品，加水，称定质量。分别置40℃恒温振荡提取14 h、16 h、18 h。取出，放冷，再次称定质量，用水补足减失的质量。6 000 r/min离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。各精密量取10μL，注入纤维蛋白板孔中，37℃恒温保持18 h后，测量溶圈半径。结果，14 h（2.5 mm）时最小，16 h（3.5 mm）和18 h（3.25 mm）时结果基本无差异。故确定提取16 h。

2.4 正交试验

以炮制温度（因素A）、炮制时间（因素B）、加酒量（药材量以100 g计，因素C）和焖润时间（因素D）为考察因素（因素与水平见表1），各炮制品的酶活力为评价指标，采用L9（34）正交试验法（试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3）优选地龙酒制工艺。结果显示，各因素对测定结果影响顺序为A＞B＞D＞C，最佳酒制工艺为A1B2C2D2。以极值最小的因素C为误差项进行方差分析，结果因素A对提取工艺有极显著影响（P＜0.01），因素B有显著影响（P＜0.05）。综合考虑成本并参考《安徽省中药饮片炮制规范》（2019年版）、《四川省中药饮片炮制规范》（2015年版）、《贵州省中药饮片炮制规范》（2005年版），确定最佳酒制工艺为A1B2C2D2，即每100 kg地龙，加黄酒12.5 kg拌匀，焖润30 min，70℃翻炒2 min。

表1 因素与水平Tab.1 Factors and their levels

表2 L 9（34）正交试验设计与结果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析结果Tab.3 Results of the ANOVA

2.5 验证试验

取炮制药材（每100 kg地龙、加黄酒12.5 kg拌匀，焖润30 min，70℃翻炒2 min）样品粉末（过3号筛）约0.5 g，共6份，精密称定，按振荡法提取，40℃提取16 h，精密量取供试品溶液10μL，注入纤维蛋白板孔中，37℃恒温保持18 h后，测量溶圈半径，计算酶活力。结果见表4及图1。

图1 验证试验结果Fig.1 Results of the verification test

表4 验证试验结果（n=6）Tab.4 Results of the validation test（n=6）

3 讨论

地龙作为临床活血通络常用药，其质量控制多集中在性状鉴别及氨基酸鉴别方面，但对其活血通络的主要有效成分蚯蚓纤溶酶、蚓激酶等蛋白酶的报道较少[15］。本研究中发现，不同的工艺参数对蛋白酶活性影响较大，这可能与酶受热易变性失活有关，提示炮制过程中应注意炮制温度和翻炒时间，避免对其中的活性成分造成过度破坏，从而影响药效。另有报道显示，酒制地龙较生品地龙在止咳、平喘方面疗效有增强，与其中的次黄嘌呤受热含量增加有关[16］，提示在地龙酒制过程中，除保证蛋白酶活性外，还应考虑炮制品的具体用药方向。

总之，地龙的炮制在注意除臭矫味的同时，还需注意有效成分的保护、转化。本研究中采用水提法、正交试验法、纤维蛋白平板法，对炮制品的酶活力进行测定，可对地龙的酒制工艺进行优化，有助于保留其有效成分。