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鬼点灯药材脂溶性成分及抗氧化活性研究*

2023-03-02赵小超胡筱希程英歌廖承谱

中国药业 2023年4期
关键词:点灯溶性自由基

赵小超,胡筱希,程英歌,柴 玲,商 勋,廖承谱

(1.江苏省宿迁市中医院,江苏 宿迁 223800;2.广西中医药研究院,广西 南宁 530022;3.江苏省宿迁市第一人民医院,江苏 宿迁 223800;4.浙江大学金华研究院,浙江 金华 321000)

鬼点灯为紫草科植物柔弱斑种草Bothriospermumtenellum(Hornem.)Fisch.Et Mey.的全草,又名细叠子草、雀灵草、小马耳朵,国内各地均有分布,国外主要分布在朝鲜、日本、越南、印度、巴基斯坦及俄罗斯中亚等地区,以全草入药,味微苦、涩,性平,有小毒,归肺经,具有止咳、止血功效[1],并明确记载于《民间常用草药汇编》《中药大辞典》《中华本草》,应用历史悠久,疗效确切。国内外文献暂无关于鬼点灯化学成分的报道,对于鬼点灯的现代研究也未见报道,江苏省扬州市及关中等多地区进行麦田杂草危害调查,结果显示均有鬼点灯药材[2],其本身并无大害且具有一定的药用价值,却被视为杂草。本研究中采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪,以鬼点灯石油醚提取物为研究对象,分析其化学成分,并采用清除自由基试验研究其抗氧化活性作用。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器:8860-5977B型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent公司);UV2550型紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu公司);XS205型分析天平(精度为十万分之一,意大利Mettler Toledo公司);RE-52A A型旋转蒸发器、SHB-Ⅲ型真空泵(郑州长城科工贸易有限公司);CA-1115A型冷却水循环装置(上海爱郎仪器有限公司)。

试药:1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,批号为EKKS1297)、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS,批号为EK171020),均购自美国Sigma公司;维生素C(华中药业股份有限公司,批号为20220108);95%乙醇、石油醚(60~90℃)、甲醇、无水乙醇等均为国产分析纯;水为纯净水。鬼点灯采于江苏省宿迁市宿豫区曹集乡田间,经广西壮族自治区中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 试验条件

色谱条件:色谱柱为DB-WAX UI毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);进样口温度为250℃;检测器温度为250℃;进样量为1μL;分流比为10∶1;载气为氦气,恒流模式,流速为3.5 mL/min;尾吹气流速为20 mL/min;空气流速为450 mL/min;氢气流速为40 mL/min;程序升温(初始温度40℃、保持3 min,以3℃/min的速率升至250℃,保持20 min)。

质谱条件:电离方式为EI源;电子能量为70 eV;离子源温度为230℃;四极杆温度为150℃;传输线温度为250℃;质量范围m/z35~500。

2.1.2 供试品溶液制备

取药材样品适量,剪段,以95%乙醇回流提取,10倍量提取3次,以旋转蒸发仪减压回收溶剂,收集合并浓缩物得总浸膏。采用系统溶剂法萃取,浓缩,得石油醚提取物(以下简称样品);取适量,以甲醇超声(功率100 W,频率40 kHz;下同)溶解,制成质量浓度为0.1 mg/mL的溶液,经0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液Ⅰ。

2.1.3 图谱分析

取上述供试品溶液Ⅰ适量,按2.1.1项下试验条件进样测定,记录总离子流色谱图(见图1)。通过标准质谱谱库检索比对,并采用面积归一化法计算各组分相对含量。共检出46个化学成分,鉴定出其中22个主要化学成分(见表1),以脂肪酸、脂肪醇、脂溶性维生素以及香豆素类化学成分为主,其中含量较高的有棕榈酸、反式-13-十八碳烯酸、生育酚、5,7-二甲氧基香豆素、肌醇。

表1 22个主要化学成分分析结果Tab.1 Analysis results of 22 main chemical constituents

图1 总离子流色谱图Fig.1 TIC chromatogram

2.2 抗氧化试验

2.2.1 DPPH自由基清除实验

溶液制备:取样品100 mg,精密称定,加无水乙醇定容至10 mL,制成供试品溶液Ⅱ,使用前用无水乙醇倍比稀释成质量浓度分别为1 000,500,250,125,62.5,31.25,15.26,7.63,3.81μg/mL的系列供试品溶液。以维生素C(VC)为阳性对照,同法制成阳性对照品溶液。取DPPH适量,精密称定,用无水乙醇超声溶解,制成质量浓度为254μg/mL的标准贮备液。

方法:取系列供试品溶液各适量,分别加样到96孔板中,每孔20μL,然后每孔平行加入贮备液Ⅰ(标准贮备液以无水乙醇稀释10倍)180μL,每个质量浓度设置3个平行,同时设立阳性对照及空白对照(70%乙醇200μL)。充分混匀后将96孔板放置在避光环境下反应30 min,在515 nm波长处测定吸光度(A),并计算清除率[3-5]。清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%,其中A0为标准贮备液和空白对照溶液混匀后测得的吸光度;Ai为标准贮备液和供试品溶液混匀后测得的吸光度;Aj为空白对照溶液和供试品溶液混匀后测得的吸光度(下同)。以供试品溶液质量浓度为横坐标,清除率为纵坐标作图。

结果:结果见图2。脂溶性成分抗氧化活性在3.81~1 000μg/mL质量浓度范围内呈明显的剂量依赖性,经SPSS22.0统计学软件计算得脂溶性成分半数抑制浓度(IC50)为208.69μg/mL,阳性对照的IC50为25.80μg/mL。当质量浓度达到1 000μg/mL时,鬼点灯脂溶性成分清除DPPH自由基能力与阳性对照非常接近,且前者仍呈上升趋势。结果显示,虽然在一定质量浓度范围内,供试品抗氧化活性弱于阳性对照,但供试品溶液质量浓度均处于μg/mL级别,说明鬼点灯脂溶性成分的DPPH自由基清除能力(即抗氧化活性)较强。

图2 脂溶性成分对DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of liposoluble constituents to DPPH free radical

2.2.2 ABTS+自由基清除实验

溶液制备:分别取ABTS(7 mmol/L)和过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)各3 mL,混合均匀,室温避光条件下静置过夜,制成贮备液Ⅱ。

方法:以70%乙醇将贮备液Ⅱ的A调至0.700±0.005后使用。取2.2.1项下系列供试品溶液各适量,分别加样到96孔板中,每孔40μL,然后每孔平行加入贮备液Ⅱ160μL,每个质量浓度设置3个平行,同时设立阳性对照(VC)及空白对照(70%乙醇200μL)。重复混合10 s,静置6 min,在734 nm波长处测定A,并计算清除率。

结果:结果见图3。脂溶性成分抗氧化活性在3.81~1 000μg/mL质量浓度范围内呈明显的剂量依赖性。经计算,脂溶性成分的IC50为146.00μg/mL,阳性对照的IC50为21.20μg/mL。当质量浓度达到1 000μg/mL时,鬼点灯脂溶性成分清除ABTS+自由基能力与阳性对照接近,且前者清除ABTS+自由基能力仍呈上升趋势。结果显示,虽然在一定质量浓度范围内供试品抗氧化活性弱于阳性对照,但供试品溶液质量浓度均处于μg/mL级别,说明鬼点灯脂溶性成分ABTS+自由基清除能力(即抗氧化活性)较强。

图3 脂溶性成分对ABTS+自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of liposoluble constituents to ABTS+free radical

3 讨论

鬼点灯石油醚提取物经GC-MS法共检测出48个脂溶性成分,鉴定了22个主要成分,包含脂肪酸、脂肪醇、脂溶性维生素及香豆素等类化合物。抗氧化活性试验显示,鬼点灯脂溶性成分具有较强的抗氧化活性,与其化学成分检测结果前后呼应,印证了检测结果的可靠性。本研究作为鬼点灯药材试验方面的公开报道,首次从该植物石油醚提取物中鉴别出22个化学成分,也证明了其抗氧化活性较强。

天然饱和脂肪酸广泛存在于自然界植物中,其中棕榈酸含量较多,研究与应用也较多。有研究表明,棕榈酸可促进p-65磷酸化上调KLF7表达,引发脂肪细胞炎性反应,抑制细胞GLUT4表达及葡萄糖消耗能力,主要通过激活GPR40/GPR120发挥以上作用[6];棕榈酸还具有促进抵抗素-诱导SH-SY5Y人神经母细胞瘤胰岛素抵抗和炎性反应、诱导骨骼肌细胞脂质沉积的作用[7-8],是精神分裂症急性期主要治疗药物棕榈酸帕利哌酮的合成底物之一[9]。本研究中鉴定出的生育酚为天然维生素E的重要组成部分,具有较强的抗氧化、抗癌、抗不孕、增强机体免疫功能等作用[10]。肌醇是维持人体生理功能不可缺少的物质,可治疗各种维生素缺乏症、多囊卵巢综合征、精神及神经性疾病等多种疾病,还具有较强的抗癌作用,是“抗癌之王”肌醇硒酸酯的重要原料[11-12]。国内外研究表明天然抗氧化剂的安全性远高于合成抗氧化剂[13-14],本研究中发现鬼点灯药材石油醚提取物含有大量的天然抗氧化成分,可为天然抗氧剂的制备提供更多物质基础。

综上所述,本研究中首次鉴定出鬼点灯药材脂溶性成分主要含有脂肪酸类、脂肪醇类及维生素类成分;该类成分抗氧化活性较强。

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