鬼点灯药材脂溶性成分及抗氧化活性研究*

赵小超，胡筱希，程英歌，柴 玲，商 勋，廖承谱

（1.江苏省宿迁市中医院，江苏 宿迁 223800；2.广西中医药研究院，广西 南宁 530022；3.江苏省宿迁市第一人民医院，江苏 宿迁 223800；4.浙江大学金华研究院，浙江 金华 321000）

鬼点灯为紫草科植物柔弱斑种草Bothriospermumtenellum（Hornem.）Fisch.Et Mey.的全草，又名细叠子草、雀灵草、小马耳朵，国内各地均有分布，国外主要分布在朝鲜、日本、越南、印度、巴基斯坦及俄罗斯中亚等地区，以全草入药，味微苦、涩，性平，有小毒，归肺经，具有止咳、止血功效[1］，并明确记载于《民间常用草药汇编》《中药大辞典》《中华本草》，应用历史悠久，疗效确切。国内外文献暂无关于鬼点灯化学成分的报道，对于鬼点灯的现代研究也未见报道，江苏省扬州市及关中等多地区进行麦田杂草危害调查，结果显示均有鬼点灯药材[2］，其本身并无大害且具有一定的药用价值，却被视为杂草。本研究中采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪，以鬼点灯石油醚提取物为研究对象，分析其化学成分，并采用清除自由基试验研究其抗氧化活性作用。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：8860-5977B型气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；UV2550型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；XS205型分析天平（精度为十万分之一，意大利Mettler Toledo公司）；RE-52A A型旋转蒸发器、SHB-Ⅲ型真空泵（郑州长城科工贸易有限公司）；CA-1115A型冷却水循环装置（上海爱郎仪器有限公司）。

试药：1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH，批号为EKKS1297）、2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，批号为EK171020），均购自美国Sigma公司；维生素C（华中药业股份有限公司，批号为20220108）；95%乙醇、石油醚（60～90℃）、甲醇、无水乙醇等均为国产分析纯；水为纯净水。鬼点灯采于江苏省宿迁市宿豫区曹集乡田间，经广西壮族自治区中医药研究院黄云峰副研究员鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 试验条件

色谱条件：色谱柱为DB-WAX UI毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；进样口温度为250℃；检测器温度为250℃；进样量为1μL；分流比为10∶1；载气为氦气，恒流模式，流速为3.5 mL/min；尾吹气流速为20 mL/min；空气流速为450 mL/min；氢气流速为40 mL/min；程序升温（初始温度40℃、保持3 min，以3℃/min的速率升至250℃，保持20 min）。

质谱条件：电离方式为EI源；电子能量为70 eV；离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；传输线温度为250℃；质量范围m/z35～500。

2.1.2 供试品溶液制备

取药材样品适量，剪段，以95%乙醇回流提取，10倍量提取3次，以旋转蒸发仪减压回收溶剂，收集合并浓缩物得总浸膏。采用系统溶剂法萃取，浓缩，得石油醚提取物（以下简称样品）；取适量，以甲醇超声（功率100 W，频率40 kHz；下同）溶解，制成质量浓度为0.1 mg/mL的溶液，经0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液Ⅰ。

2.1.3 图谱分析

取上述供试品溶液Ⅰ适量，按2.1.1项下试验条件进样测定，记录总离子流色谱图（见图1）。通过标准质谱谱库检索比对，并采用面积归一化法计算各组分相对含量。共检出46个化学成分，鉴定出其中22个主要化学成分（见表1），以脂肪酸、脂肪醇、脂溶性维生素以及香豆素类化学成分为主，其中含量较高的有棕榈酸、反式-13-十八碳烯酸、生育酚、5，7-二甲氧基香豆素、肌醇。

表1 22个主要化学成分分析结果Tab.1 Analysis results of 22 main chemical constituents

图1 总离子流色谱图Fig.1 TIC chromatogram

2.2 抗氧化试验

2.2.1 DPPH自由基清除实验

溶液制备：取样品100 mg，精密称定，加无水乙醇定容至10 mL，制成供试品溶液Ⅱ，使用前用无水乙醇倍比稀释成质量浓度分别为1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.26，7.63，3.81μg/mL的系列供试品溶液。以维生素C（VC）为阳性对照，同法制成阳性对照品溶液。取DPPH适量，精密称定，用无水乙醇超声溶解，制成质量浓度为254μg/mL的标准贮备液。

方法：取系列供试品溶液各适量，分别加样到96孔板中，每孔20μL，然后每孔平行加入贮备液Ⅰ（标准贮备液以无水乙醇稀释10倍）180μL，每个质量浓度设置3个平行，同时设立阳性对照及空白对照（70%乙醇200μL）。充分混匀后将96孔板放置在避光环境下反应30 min，在515 nm波长处测定吸光度（A），并计算清除率[3-5］。清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0］×100%，其中A0为标准贮备液和空白对照溶液混匀后测得的吸光度；Ai为标准贮备液和供试品溶液混匀后测得的吸光度；Aj为空白对照溶液和供试品溶液混匀后测得的吸光度（下同）。以供试品溶液质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图。

结果：结果见图2。脂溶性成分抗氧化活性在3.81～1 000μg/mL质量浓度范围内呈明显的剂量依赖性，经SPSS22.0统计学软件计算得脂溶性成分半数抑制浓度（IC50）为208.69μg/mL，阳性对照的IC50为25.80μg/mL。当质量浓度达到1 000μg/mL时，鬼点灯脂溶性成分清除DPPH自由基能力与阳性对照非常接近，且前者仍呈上升趋势。结果显示，虽然在一定质量浓度范围内，供试品抗氧化活性弱于阳性对照，但供试品溶液质量浓度均处于μg/mL级别，说明鬼点灯脂溶性成分的DPPH自由基清除能力（即抗氧化活性）较强。

图2 脂溶性成分对DPPH自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of liposoluble constituents to DPPH free radical

2.2.2 ABTS+自由基清除实验

溶液制备：分别取ABTS（7 mmol/L）和过硫酸钾溶液（2.45 mmol/L）各3 mL，混合均匀，室温避光条件下静置过夜，制成贮备液Ⅱ。

方法：以70%乙醇将贮备液Ⅱ的A调至0.700±0.005后使用。取2.2.1项下系列供试品溶液各适量，分别加样到96孔板中，每孔40μL，然后每孔平行加入贮备液Ⅱ160μL，每个质量浓度设置3个平行，同时设立阳性对照（VC）及空白对照（70%乙醇200μL）。重复混合10 s，静置6 min，在734 nm波长处测定A，并计算清除率。

结果：结果见图3。脂溶性成分抗氧化活性在3.81～1 000μg/mL质量浓度范围内呈明显的剂量依赖性。经计算，脂溶性成分的IC50为146.00μg/mL，阳性对照的IC50为21.20μg/mL。当质量浓度达到1 000μg/mL时，鬼点灯脂溶性成分清除ABTS+自由基能力与阳性对照接近，且前者清除ABTS+自由基能力仍呈上升趋势。结果显示，虽然在一定质量浓度范围内供试品抗氧化活性弱于阳性对照，但供试品溶液质量浓度均处于μg/mL级别，说明鬼点灯脂溶性成分ABTS+自由基清除能力（即抗氧化活性）较强。

图3 脂溶性成分对ABTS+自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of liposoluble constituents to ABTS+free radical

3 讨论

鬼点灯石油醚提取物经GC-MS法共检测出48个脂溶性成分，鉴定了22个主要成分，包含脂肪酸、脂肪醇、脂溶性维生素及香豆素等类化合物。抗氧化活性试验显示，鬼点灯脂溶性成分具有较强的抗氧化活性，与其化学成分检测结果前后呼应，印证了检测结果的可靠性。本研究作为鬼点灯药材试验方面的公开报道，首次从该植物石油醚提取物中鉴别出22个化学成分，也证明了其抗氧化活性较强。

天然饱和脂肪酸广泛存在于自然界植物中，其中棕榈酸含量较多，研究与应用也较多。有研究表明，棕榈酸可促进p-65磷酸化上调KLF7表达，引发脂肪细胞炎性反应，抑制细胞GLUT4表达及葡萄糖消耗能力，主要通过激活GPR40/GPR120发挥以上作用[6］；棕榈酸还具有促进抵抗素-诱导SH-SY5Y人神经母细胞瘤胰岛素抵抗和炎性反应、诱导骨骼肌细胞脂质沉积的作用[7-8］，是精神分裂症急性期主要治疗药物棕榈酸帕利哌酮的合成底物之一[9］。本研究中鉴定出的生育酚为天然维生素E的重要组成部分，具有较强的抗氧化、抗癌、抗不孕、增强机体免疫功能等作用[10］。肌醇是维持人体生理功能不可缺少的物质，可治疗各种维生素缺乏症、多囊卵巢综合征、精神及神经性疾病等多种疾病，还具有较强的抗癌作用，是“抗癌之王”肌醇硒酸酯的重要原料[11-12］。国内外研究表明天然抗氧化剂的安全性远高于合成抗氧化剂[13-14］，本研究中发现鬼点灯药材石油醚提取物含有大量的天然抗氧化成分，可为天然抗氧剂的制备提供更多物质基础。

综上所述，本研究中首次鉴定出鬼点灯药材脂溶性成分主要含有脂肪酸类、脂肪醇类及维生素类成分；该类成分抗氧化活性较强。