TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路对甲基苯丙胺依赖CPP 大鼠海马的影响

张 园 ，朱婷娜 ，曹媛媛 ，刘鹏亮 ，王一航 ，吴亚梅 ，李利华 ，赵永娜 ，洪仕君

（1）昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室;2）法医学院;3）国际教育学院，云南 昆明 650500）

甲基苯丙胺（methamphetamine，MA），属于苯丙胺类兴奋剂，可进入血脑屏障导致大脑的结构和功能的改变[1]，其滥用诱发大脑多个脑区发生不同程度的神经损伤，从而诱导中枢神经系统神经毒性的产生[2]。研究发现[3]MA 依赖引起的神经毒性损伤海马脑区损伤有重要联系。MA 诱导海马神经毒性的产生与单胺类神经递质释放增加[4−5]、ROS 和NOS 的产生、大脑免疫细胞的激活、凋亡与自噬[6]和神经炎症[7]等有关。Toll 样受体（Toll like receptors，TLR），能够调控免疫及炎症反应[8]，主要在小胶质细胞中表达[9]。TLR4细胞内信号通路分为髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性和β 干扰素TIR 结构域衔接蛋白（TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）依赖性通路。在MyD88 依赖途径中当外界因素触发后，细胞表面的刺激信号通过TLR4-MyD88-TRAF6-IκBPIκB-NF-κB 分子传递到细胞核，从而调节相关炎症因子的转录[10]。颅脑外伤可以诱导神经元凋亡和神经炎症，从而导致严重的神经元损害和行为障碍[11]，其中TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的激活是造成中枢神经系统损伤的关键原因。在体外实验中脂多糖损伤的 BV2 小胶质细胞和神经炎症损伤的原代皮层神经元中采用TLR4 抑制剂 TAK-242 所产生的抗神经炎症作用主要是与TLR4 介导的 MyD88/NF-κB 信号通路的调节有关[12]。Li B 等[13]的体外实验表明阻断 TLR4 介导的信号转导，TLR4/MyD88/NF-κB 和 MAPK 通路的激活便会受到影响，从而抑制 BV-2 小胶质细胞中脂多糖刺激所产生神经炎症。TLR4/MyD88/NF-κB 作为一条经典的炎性通路，在MA 诱导的海马神经炎症中具有较大的研究价值。本研究旨在探究研究TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路对甲基苯丙胺CPP 大鼠海马的影响，同时采用特异性抑制剂TAK-242 抑制TLR4，在改善MA 依赖海马神经炎症中的作用，为药物干预甲基苯丙胺依赖提供新的科学证据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：健康雄性SD 大鼠40 只，选择体重在180～200 g，购于昆明医科大学实验动物学中心[动物使用许可证编号：SCXK（滇）K2015-002]。

药品试剂：实验所用甲基苯丙胺，由云南省公安厅禁毒技术公安部重点实验室合法提供，纯度在98%以上。BestarTMqPCR RT Kit、荧光定量试剂盒（DBI Bioscience）；引物合成（擎科生物科技有限公司）；TLR4 受体抑制剂（TAK-242，A3850，Apexbio 公司MyD88 抗体（ab2064，Abcam 公司）；TRAF6 抗体（66494，Proteintech 公司）；IκB-α抗体（9242，CST 公司）；p-IκB-α 抗体（2859，CST 公司）；NF-κB p65 抗体（8142s，CST 公司）；p-NF-κB p65 抗体（sc-136548，Santa Cruz Biotechnology 公司）；TLR4 抗体（sc-293072，Santa Cruz Biotechnology 公司）；β-actin 抗体（ab6276，购自美国Abcam 公司）。

主要仪器：大鼠 CPP 实验箱（XR-XT401，上海欣软信息有限公司）；酶标仪（Touch 2，美国BioTek 公司）；普通PCR 仪、荧光定量 PCR 仪（T100TM Thermal Cycler、C1000 Touch TM Thermal Cycler，美国Bio-Rad 公司）；垂直电泳仪、半干转膜仪（552BR、221BR，美国Bio-Rad 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及给药健康雄性SD 大鼠40 只，随机分配为4 组，包括生理盐水组：腹腔注射（生理盐水（10 mg/kg，qd，14 d）；MA 实验组：给药 MA（10 mg/kg，ip，qd，14 d），大鼠形成MA 依赖，CPP 模型建模成功；TAK-242 组：给药 TAK-242（3 mg/kg，ip，qd，14 d）；MA+TAK-242 组：给药 TAK-242（3 mg/kg，ip，qd，14 d）后1 h 给予 MA（10 mg/kg，ip，qd，14 d）。

1.2.2 条件性位置偏爱模型（CPP）连续3 d 将随机分组的大鼠放入实验检测的黑白箱中以适应检测环境，第4 天检测每只大鼠的天然偏好时间；连续14 d 对大鼠以10 mg/kg 的MA 进行腹腔注射给药，使得大鼠产生依赖，再进行CPP 检测。

1.2.3 WesternBlot 实验用 10%的水合氯醛，按0.3 m L/100 g 麻醉后迅速水合氯醛麻醉大鼠，用0.9%的氯化钠注射液对大鼠心脏灌注，将脑血管中的血液冲洗干净断头，取出全脑，分离大鼠海马组织解剖大鼠，取大鼠海马组织，匀浆，测定蛋白浓度。配制10%和12%的分离胶；上样、电泳，转膜、孵育一抗（β-actinantibody Anti-TLR4、Anti-Myd88、Anti-TRAF6、Anti-IκB-α、Anti-pIκB-α、Anti-NF-κBp65、Anti-P-NFκBp65 均按照1∶1000 配制），放入4 ℃过夜，1xTBST 漂洗3 次，温室孵育二抗（2 h），再次漂洗，采用ECL 显影。Image Pro Plus 图像分析软件分析目的条带与对应内参（β-actin）条带二者平均光密度比值，最后进行统计学分析。

1.2.4 荧光定量PCR 实验取海马组织80 mg，放入 EP 管中，匀浆，用酶标仪测定RNA 浓度；按照说明书逆转录合成cDNA；荧光实时定量PCR 仪，经94 ℃ 5 min 预变性、94 ℃变性、58 ℃退火、72 ℃延伸，此循环进行40 次，采用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，荧光定量PCR 引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR 引物序列Tab.1 Fluorescence quantitative PCR primer sequence

1.3 统计学处理

采用 SPSS 19.0 进行数据分析，数值代表均数±标准差（）表示，用于统计分析的Prism软件5.0 作图（GraphPad software），组内给药前后比较采用配对t检验；组间多组比较采用多因素方差分析（Multi-factor analysis of variance），多重比较方法采用 Tukey-HSD，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲基苯丙胺依赖CPP 大鼠海马中TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、p-IκB-α、NFκBp65、p-NF-κBp65 蛋白表达

TLR4 蛋白变化：图1A 结果显示与生理盐水组相比，MA 组TLR4 蛋白表达升高（P<0.01）；与MA 组相比，MA+TAK-242 组TLR4 的蛋白表达下降（P<0.01）。

MyD88 蛋白变化：图1B 结果显示与生理盐水组相比，MA 组MyD88 蛋白表达升高（P<0.01）；与MA 组相比，MA+TAK-242 组MyD88 蛋白表达下降（P<0.01）。

TRAF6 蛋白变化：图1C 结果显示与生理盐水组相比，MA 组TRAF6 的蛋白表达升高（P<0.01）；与MA 组相比，MA+TAK-242 组TRAF6的蛋白表达下降（P<0.01）。

图1 大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路蛋白表达水平变化。Fig.1 The protein expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus of rats

p-IκB-α 蛋白变化：图1D 结果显示与生理盐水组相比，MA 组p-IκB-α 蛋白表达升高p-IκB-α 蛋白表达升高（P<0.05），与MA 组相比，MA+TAK-242 组p-IκB-α 蛋白表达下降（P<0.01）。

IκB-α 蛋白变化：图1E 结果显示与生理盐水组相比，MA 组IκB-α 蛋白表达降低（P<0.01）；与MA 组相比，MA+TAK-242 组IκB-α蛋白表达升高（P<0.01）。

p-NF-κBp65 蛋白变化：图1F 结果显示与生理盐水组相比，MA 组p-NF-κBp65 蛋白表达升高（P<0.05）；与MA 组相比，MA+TAK-242 组的p-NF-κBp65 蛋白表达下降（P<0.05）。

NF-κBp65 蛋白变化：图1G 结果显示与生理盐水组相比，MA 组NF-κBp65 蛋白表达升高（P<0.01）；与MA 组相比，MA+TAK-242 组的NF-κBp65 蛋白表达下降（P<0.05）。

上述结果提示MA 可通过TLR4/MyD88/NFκB 信号通路诱导MA 依赖CPP 大鼠海马发生神经炎症。

2.2 甲基苯丙胺依赖CPP 大鼠海马中TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、NF-κBp65mRNA表达

TLR4 mRNA 表达变化见表2 和图2A，结果显示与生理盐水组相比，MA 组TLR4mRNA 表达上升（P<0.01）；与MA 组相比，MA+TAK-242组TLR4mRNA 表达下降（P<0.01）。

图2 大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路的mRNA 表达水平统计结果Fig.2 The mRNA expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus

表2 大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路的mRNA 表达（n=6，）Tab.2 The mRNA expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus of rats（n=6，）

表2 大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路的mRNA 表达（n=6，）Tab.2 The mRNA expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus of rats（n=6，）

与对照组进行比较，**P < 0.01，***P < 0.001；与MA组进行比较，##P < 0.05 ，###P < 0.001。

MyD88 mRNA 表达变化：表2 和图2B 结果显示与生理盐水组相比，MA 组MyD88mRNA 表达上升（P<0.01）；与M 组相比，MA+TAK-242组MyD88mRNA 表达下降（P<0.01）。

TRAF6 mRNA 表达变化：表2 和图2C 结果显示与生理盐水组相比，MA 组TRAF6mRNA 表达上升（P<0.01），与MA 组相比，MA+TAK-242组TRAF6mRNA 表达下降（P<0.01）。

IκB-α mRNA 表达变化：表2 和图2D 结果显示与生理盐水组相比，MA 组IκB-α mRNA表达下降（P<0.01），与MA 组相比，MA+TAK-242 组IκB-α mRNA 表达上升（P<0.01）。

NF-κBp65 mRNA 表达变化：表2 和图2E结果显示与生理盐水组相比，MA 组NF-κBp65 mRNA 表达上升（P<0.001），与MA 组相比，MA+TAK-242 组NF-κBp65 mRNA 表达下降（P<0.001）。

3 讨论

已有研究表明，MA 依赖诱导海马神经炎症，造成了神经系统的损害。炎性因子过渡累积就会对机体产生严重的危害，其中与损害最为严重的海马脑区为例。本研究发现MA 依赖的CPP 大鼠激活了海马脑区TLR4/MYD88/NF-κB 信号通路，诱导了海马神经炎症的发生。

TLR4 作为天然免疫识别受体，通过Myd88通路发挥作用[14，15]。本研究表明：与对照组相比，MA 组TLR4、MyD88、TRAF6 蛋白和mRNA 表达均增加。Xie 等[16]的研究发现，在MA 中毒大鼠模型中，MA 可使大鼠纹状体中 TLR4，MyD88，TRAF6 蛋白表达增加；Du 等的研究在 MA 中毒小鼠模型中，MA 也可使中脑和纹状体中TLR4蛋白表达增加[8,17]，上述结果均与与本研究结果一致，但是本研究对于海马脑区的检测不仅包含上述因子蛋白水平的变化，还在mRNA 水平进一步验证了MA 依赖可通过激活TLR4/MyD88 信号通路，诱导海马神经炎症发生。Qing-Peng Hu 等[18]的研究表明，组蛋白乙酰化调节抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI）可抑制TLR4/MYD88信号通路中TLR4 的表达，从而抑制小胶质细胞激活和神经元凋亡，这就表明阻断TLR4 对神经炎症诱导的脑损伤具有潜在的神经保护作用。本研究采用TLR4 受体抑制剂TAK-242 预处理，特异性地抑制了海马脑区TLR4 的表达，减少了MyD88、TRAF6 的蛋白及mRNA 的表达。

研究发现多种分子机制可以介导炎症过程，其中最显著的机制是通过核因子NF-κB 信号通路[19]，磷酸化的NF-κB 抑制因子（inhibitor of NFκB，IκB），使IKB 降解，进而激活NF-κB，其中p65 是NF-κB 的主要活性亚单位[20]。本研究采用Western blot 检测MA 依赖CPP 大鼠海马中p-IκB-α、NF-κBp65、p-NF-κBp65 蛋白表达均增加，IκB-α 的蛋白表达下降。Liu X 等发现[21]，苦碟子注射液（KDZ）可通过下调TLR4依赖性 NF-κB 信号通路，降低TRAF6、NFκBp65 和p-IκBα/IκBα 的蛋白表达，保护大脑免受缺血性损伤。Long H 等也发现[22]，在大鼠Tourette 综合征（TS）模型中，TS 大鼠纹状体中IκB-α 蛋白表达降低，p-IκB-α 蛋白表达升高，结果均与本研究一致。不同的是本研究采用特异性TLR4 拮抗剂TAK-242 预处理后，p-IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65 蛋白表达降低，IκB-α 蛋白表达增加。此外，本研究发现IκBαmRNA 表达降低、NF-κBp65 mRNA 表达增加，结果与蛋白水平一致。采用TLR4 受体抑制剂（TAK-242）预处理，特异性地抑制了海马脑区TLR4 的表达，减少了的NF-κB 通路关键蛋白及mRNA 的表达，从而减轻MA 依赖大鼠海马脑区的神经炎症。

综上所述，TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路参与了MA 依赖大鼠CPP 效应的形成，该信号通路的激活可以诱导MA 依赖大鼠海马神经炎症的发生。采用特异性的TLR4 抑制剂可以改变TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路相关的因子的表达，减轻MA 依赖的海马神经炎症。