欣力康提取物调控STAT3/NF-κB信号通路对膀胱癌细胞增殖、迁移的影响

顾红勇 林鹏修 胡劲 吴敏红 余知灵 刘彩玲

(宜春市人民医院泌尿外科，江西 宜春 336000)

膀胱癌具有极高的复发率和死亡率，并且复发后的膀胱癌恶性度增高、浸润能力增强〔1,2〕。据统计，每年患膀胱癌的患者将近40万，而死亡人数可达15万〔3〕。近年来，由于诊断水平的完善与提高，发病率有所降低，但该病的死亡率却一直不下降〔4〕。研究指出，新型化疗对部分膀胱癌患者有一定的疗效，但是此等免疫靶向治疗还是有一定的局限性，急需发现新的治疗途径和药物〔5〕。并且探究膀胱癌的发生发展机制、寻找治疗的靶点是降低膀胱癌病死率的关键。欣力康当中有10种药材，其中最主要的当归、黄芪等都是补气养血、化瘀解毒、对癌症放化疗有一定辅助作用的药材〔6〕。有研究表明，欣力康提取物对人肿瘤细胞增殖有一定的抑制作用，临床研究发现，欣力康能够抑制部分患者瘤体的生长，延缓肿瘤复发或转移〔7,8〕。但具体的作用机制并不明确，且目前关于欣力康提取物对于膀胱癌的作用及其机制研究较少，因此本文旨在探讨欣力康提取物对膀胱癌细胞增殖和迁移的影响，并研究其具体机制。

1 资料与方法

1.1材料与仪器 膀胱癌细胞株5637(佰晔生物科技中心)；欣力康胶囊(贵阳新天药业股份有限公司)；培养液(光语生物科技有限公司)；胎牛血清(九龙生物制品有限公司)；显微镜(无陌光学仪器有限公司)；四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)、离心机(继谱电子科技有限公司)；基质胶、Transwell侵袭室(抚生实业有限公司)；所需试剂盒、抗体(晶抗生物工程有限公司)；酶标仪、培养箱(风途实力生产厂)。

1.2细胞培养 采用含有胎牛血清的培养基，在37℃、5%CO2的培养箱中保存，将其分为空白对照组和不同浓度的欣力康组，空白对照组不做培养，其余组分别加入0.5、2.0、5.0 mg/L的欣力康提取物。

1.3欣力康提取物制备 取欣力康胶囊粉末加乙醇回流提取2 h，过滤；然后将醇提后的药渣分别加水提取2 h，过滤后沉淀，然后再次加乙醇静置24 h，取上清液过滤，合并两次滤液备用。

1.4测定细胞增殖能力 将细胞接种于孔板上，共3个孔，置孔板于37 ℃、5% CO2培养箱24 h后，丢弃上清，药物组中每个孔加入200 μl改良杜氏伊格尔培养基(DMEM)稀释的不同浓度的药物培养12 h、24 h，空白对照组只加入 200 μl的DMEM培养，在结束前4 h 每孔加入20 μl MTT 5 g/L，4 h后弃上清液，每个孔都加入二甲基亚砜(DMSO)，测定吸光值。然后计算抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD 值)×100% 。

1.5测定细胞侵袭能力 按比例加入基质胶至预冷的培养基中，取稀释的基质胶加入板上室，将整个膜放入培养箱中，消化后再进行离心，5 min后悬浮，下室加入含血清的培养基，下室加细胞悬液，适宜环境下继续培养24 h，最后进行冲洗、染色，显微镜下观察结果。

1.6测定细胞迁移能力 每组设3个复孔，接种原则为过夜后融合率达100%，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞一次后，去除划下的细胞，加入药物培养基在37℃下培养24 h，拍照。

1.7测定细胞侵袭、迁移相关蛋白表达 取培养好的细胞提取总蛋白，加入PBS后煮沸，然后进行电泳分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脱脂后封存1 h，一次加入一抗、二抗，2 h后再次洗膜，然后发光、显影，扫视灰度值，估计蛋白水平。

1.8荧光素酶活性测定 收集细胞，以1 000 r/min速度离心5 min，弃上清，然后将细胞悬液接种到培养板中培养48 h，然后加入欣力康提取物，培养1 h后计入激动剂，继续培养，然后弃去培养基，每孔加入细胞裂解液，使细胞裂解。酶标仪检测，计算抑制率。

1.9统计学方法 采用SPSS23.0软件进行方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结 果

2.1测定细胞增殖能力 欣力康提取物对细胞增殖均有明显抑制作用，且呈时间剂量依赖性(P<0.05)，见表1。由于欣力康提取物对细胞作用24 h后，抑制作用更强，因此后面实验均研究24 h的结果。

表1 欣力康对细胞增殖能力的影响

2.2测定细胞侵袭能力 与空白对照组比较，欣力康不同浓度组侵袭细胞个数明显减少，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表2、图1。

2.3测定细胞迁移能力 与空白对照组比，欣力康作用后，细胞迁移能力明显下降，且随着剂量的增加而明显降低(P<0.05)，见表2、图2。

表2 各组细胞侵袭迁移能力及相关蛋白表达比较

图1 各组细胞侵袭能力比较(结晶紫染色，×200)

图2 各组细胞迁移能力(×200)

2.4测定细胞侵袭、迁移蛋白表达 与空白对照组比较，欣力康作用后，MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白相对表达量明显下降，且随着浓度的增加而明显降低(P<0.05)，见表2、图3。

1～4:空白对照组,0.5 mg/L欣力康组,2.0 mg/L欣力康组,5.0 mg/L欣力康组图3 各组细胞MMP-2、MMP-9、E-cadherin蛋白表达

2.5欣力康提取物对信号转导和转录激活因子(STAT3)/核因子(NF)-κB信号通路活性抑制率的影响 与空白对照组比较，不同浓度的欣力康组对STAT3/NF-κB信号通路活性抑制率明显升高，且随着浓度的增加而明显升高(P<0.05)，见表3。

表3 各组细胞中STAT3/NF-κB信号 通路活性抑制率比较

3 讨 论

膀胱癌是发病率和死亡率极高的泌尿系统恶性瘤，该病病因复杂，又因为特别容易复发和转移，且早期的症状并不明显，许多患者诊断时已经到了晚期，因此导致治疗的效果并不理想〔9〕。因此，积极寻找更加高效的膀胱癌治疗方法，提高膀胱癌患者的治疗效果、减少复发、改善患者生活质量显得尤为重要〔10〕。近年来，中药调控信号通路能够解释各种肿瘤的发病机制，为肿瘤的靶向治疗提供了新方向，逐渐成为研究的热点。欣力康的处方来自于苗族，属于扶正解毒类中药，在临床上广泛应用于各种癌症的辅助治疗，如肺癌、乳腺癌等等，具有增效减毒、预防肿瘤复发和转移的功效，对膀胱癌也有一定的效果〔11〕。欣力康成分复杂，因此其对肿瘤细胞增殖的作用机制可能更复杂〔12〕。酪氨酸激酶Janus激酶(JAK)/STAT是多种低分子量可溶性蛋白质和生长所需的有机物在细胞内传递信号的常见方式，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡及炎症等过程，其中STAT1和STAT3是其家族2个重要成员，与肿瘤细胞增殖有密切关系〔13，14〕。NF-κB是影响细胞生存的一条重要通路。NF-κB1参与、影响细胞分裂、死亡等程序。研究表明，恶性瘤发生及进展与身体内低分子量可溶性蛋白质及其受体合成mRNA相关，而NF-κB1就是这个过程中最重要的一环〔15〕。有学者提到，NF-κB1活性与皮肤恶性瘤的发生发展密切相关，并且与其临床分期还有一定的联系，是预后一个监测指标〔16〕。

本研究结果提示，欣力康提取物对人膀胱癌细胞增殖有一定的抑制作用。有学者针对欣力康胶囊对肺癌细胞的影响做了研究，指出欣力康胶囊能够抑制肺癌细胞增殖，且作用机制较复杂〔17〕。本研究结果提示，欣力康提取物对人膀胱癌细胞的侵袭能力和迁移能力均有抑制作用。大量研究表明〔18，19〕，MMP-2、MMP-9、E-cadherin与肿瘤局部侵犯或远处转移有一定相关性。有学者指出，MMP-2、MMP-9在肿瘤细胞中的表达量与肿瘤侵袭和转移呈正相关，抑制其两个蛋白的表达能够减少癌细胞向其他组织侵袭和转移；并且还有研究说明，E-cadherin丢失或功能抑制与肿瘤进展有关。并且，这几个蛋白在病灶部位组织中的水平要高于病灶周边组织〔20〕。本研究结果表明在欣力康提取物抑制膀胱癌细胞侵袭和转移的过程中，侵袭和迁移蛋白表达的下调发挥了重要作用。STAT3/NF-κB信号通路参与肿瘤发生与发展，通过调控多种低分子量可溶性蛋白质和生长所需的有机物表达，与肿瘤细胞的分裂新生命体、局部侵犯或远处转移密切相关。研究指出，STAT3通路活化能够上调MMP-2/9蛋白表达水平，增强肿瘤侵袭潜能〔21〕。本研究结果提示，欣力康胶囊抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭与迁移与STAT3/NF-κB信号通路活化有关，这与其他国内外研究〔22，23〕有一定的相通之处。也有研究说明，STAT3/NF-κB信号通路能够调控MMP-2/9蛋白表达水平，最主要的是STAT3信号通路与活化E-cadherin表达也密切相关〔24〕。这也验证了本文的研究结果。