阻断Notch信号通路后补益营卫方对衰老皮肤表皮干细胞Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1表达的影响

李婷 程亚楠 周小平

(宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004)

人体皮肤从30岁左右开始进入衰退阶段。随着人们对皮肤衰老的深入认识与不断探索发现，自然衰老皮肤角质形成细胞增殖减少，脂质和胶原合成减少〔1〕，表皮稳态失衡。稳态是组织器官更新时维持恒定数量细胞的生理过程〔2〕。皮肤稳态由位于皮肤组织中干细胞的自我更新和分化维持〔3，4〕。表皮干细胞负责维持和生成成熟的表皮及其附属器官。表皮干细胞位于皮肤不同的“龛室”，有着惊人的增殖能力。通常情况下，表皮干细胞不断增殖、分化，以替换因正常分化和组织更新或损伤引起细胞死亡而损失的角质形成细胞，维持表皮稳态。众多以人或动物为模型的研究表明，衰老表皮增殖能力下降，包括在基础刺激方面和响应增殖刺激方面，这些结果最终指向对维护表皮稳态负责任的表皮干细胞，说明其涉及衰老过程〔5〕。本研究探讨，γ分泌酶抑制剂(DAPT)阻断跨膜受体蛋白(Notch)信号通路后补益营卫方对衰老皮肤表皮干细胞Notch信号通路Notch1、Notch配体蛋白(Jagged)1、重组信号结合蛋白(RBP)-Jκ和毛发分裂增强因子(Hes)1基因及蛋白表达水平的影响，探讨补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。

1 材料与仪器

1.1实验材料 实验药物：补益营卫方由生黄芪15 g、炙甘草7 g、人参5 g组成，购买于宁夏医科大学附属回医中医医院门诊部，用水煮法制备药物，终浓度为0.5 g生药/ml，放置于4℃冰箱冷藏备用。实验动物：SPF级SAMP8雄性小鼠，8月龄10只(老年组)；SPF级SAMR1雄性小鼠，3月龄10只(年轻组)，均购于北京至善健康医学研究院有限公司，生产单位：北京华阜康生物科技股份有限公司，质量合格证号：SCXK(京)2014-0004。饲养于宁夏医科大学动物实验中心。主要试剂：0.25%胰蛋白酶(Gibco公司，批号25200-072)，DAPT(MCE公司，批号HY-13027)，角质细胞无血清培养基(iCell公司，批号iCell-0019)，DispaseⅡ的DMEM/F12基础培养基(Sigma-Aldrich公司，批号D4693)，聚合酶链反应(PCR)引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，SYBR Permix Ex TaqTM Ⅱ荧光定量试剂盒(TaKaRa公司，批号DRR081S)，ReverTra Ace-α-反转录试剂盒(TOYOBO公司，批号FSK-100)，山羊抗兔IgG H&L(批号ab205718)、Anti-GAPDH抗体(批号ab37168)、Anti-activated Notch1抗体(批号ab8925)、Anti-Jagged1抗体(批号ab7771)、Anti-RBPJκ抗体-ChIP Grade(批号ab25949)、Anti-Hes1抗体(批号ab221788)(Abcam公司)。实验仪器：37℃恒温细胞培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂，型号BC-J160S)，恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司，型号DK-600S)、电热恒温震荡水槽(上海精宏实验设备有限公司，型号DK-2B)，高级分析倒置显微镜(Nikon公司，型号DS-Ri2)，Rt-PCR仪(Thermo Fisher Scientific公司，型号Applied BiosystemsTMViiA 7 Real-Time PCR System)，高速离心机(Thermo Fisher公司，型号75004250)，超高速离心机(SCILOGEX公司，型号D3024R)，Mini.P-4型电泳槽(北京凯元信瑞仪器有限公司，型号MP-3030)。

1.2含药血清制备 SPF级雄性SAMP8小鼠，8月龄10只，予以补益营卫方10 g/kg连续灌胃1 w，1次/d，第8天末次给药1 h后，腹腔注射4%水合氯醛予以麻醉，无菌操作进行心脏采血，将血液于室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，取出血清，超净工作台无菌过滤，56℃灭活30 min，放置-80℃冰箱中保存备用。同时以DMEM培养基稀释为含2.5%补益营卫方的含药血清培养液。

1.3细胞分离、培养、传代 颈椎脱臼处死两组小鼠后，分别浸入75%乙醇消毒15 min，取小鼠背部整块皮肤，用磷酸盐缓冲液(PBS)浸洗3次后，将皮肤剪成大小为0.5 cm×0.5 cm，然后浸入含0.1%中性蛋白酶Dispase Ⅱ的DMEM/F12基础培养基中，4℃消化过夜。用镊子分离真皮与表皮，收集表皮，制备表皮细胞悬液，用80 μm滤网过筛后用离心机以1 000 r/min离心5 min，弃去培养上清液，然后加入2 ml表皮干细胞完全培养基(含0.2%角质细胞无血清培养基)，通过移液均匀制备成细胞，血球计数板计数，按4×104～5×104/cm2的密度将悬浮液接种在已包被基质胶的细胞培养瓶中。在37℃、5%CO2条件下培养细胞，每2～3 d换液，在更换液前后均在倒置显微镜下观察细胞的生长状况。当细胞融合接近75%～85%时进行传代。其中将年轻组细胞分为A组(常规培养基培养)和B组(含5 μmol/L DAPT的完全培养基培养)；老年组细胞分为3组，C组(常规培养基培养)、D组(含5 μmol/L DAPT的完全培养基培养)、E组(含5 μmol/L DAPT+2.5%药物血清浓度的完全培养基培养)。48 h后收集细胞用荧光定量PCR法定量相应指标基因表达，用Western印迹检测相应指标蛋白表达。

1.4实时荧光定量PCR检测衰老小鼠表皮干细胞Notch通路被阻断后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA表达 从GenBank下载Notch1(NM_008714.3)、Jagged1(NM_013822.5)、RBP-Jκ(NM_001080927.2)和Hes1(NM_006521797.2)mRNA序列，引物序列为：Notch1上游：5′-CAGCAAG-AAGAAGCGGAGAG-3′；下游:5′-GAGCACCATCTGAGGCATTC-3′。Jagged1上游:5′-TGGACGGAGACAA-CTGGTATC-3′；下游:5′-GGAAGACTGGCACTCATTGATG-3′。RBP-Jκ上游:5′-TTCTATGGCAACAGC-GATGAC-3′；下游:5′-GACCGAAGGCGATTGAACAG-3′。Hes1上游:5′-TCATGGAGAAGAGGCGAAGG-3′；下游:5′-CGGAGGTGCTTCACAGTCA-3′。以GAPDH为内参基因，上游:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATT-3′；下游:5′-TGAGTGGAGTCATACTGGAACA-3′。采用Trizol一步法分别提取上述各组总RNA。定量后取12 μl RNA溶液，ReverTra Ace逆转录试剂盒进行逆转录获得cDNA(具体操作参照说明书)。采用Rt-PCR仪行实时荧光定量PCR。具体操作如下：反应体系：上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，模板cDNA 2 μl，ddH2O 6.4 μl，SYBR Permix Ex TaqTM Ⅱ(2×)10 μl。反应条件：95℃、5 min，1个循环；95℃、15 s，60℃、30 s，40个循环。结果检测：采用Bio-Rad CFX Manager(Ver3.0)软件分析PCR过程，PCR扩增过程中扩增产物荧光信号超过基线值时的循环数即为样本的Ct值。以GAPDH为内参基因，软件自动得出△Ct、△△Ct及2-ΔΔCt值，由熔解曲线判断扩增产物的特异性。

1.5Western印迹检测衰老小鼠表皮干细胞Notch通路被阻断后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白表达 各组提取总蛋白后进行电泳，转膜，封闭后分别加入上述蛋白的一抗和内参GAPDH，洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗。然后加入电化学发光(ECL)试剂，化学发光系统检测，条带扫描获得灰度值，以目的基因灰度值/GAPDH灰度值作为目的基因蛋白的相对表达量。

1.6统计学处理 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1补益营卫方对衰老小鼠表皮干细胞Notch通路阻断后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白表达的影响 与A组相比，B组和C组Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平差异有统计学意义(P<0.05)；与C组比较，D组和E组Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平均明显降低(P<0.05)；与D组比较，E组Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05)，见表1。提示DAPT阻断Notch通路后，补益营卫方对衰老小鼠表皮干细胞Notch通路的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA和蛋白相对表达量具有明显的抑制作用。

表1 各组表皮干细胞Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1 mRNA相对表达及蛋白表达比较

2.2补益营卫方对衰老小鼠表皮干细胞Notch通路阻断后的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白表达的影响 B组Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1条带完全不显示，说明年轻组的4种蛋白被DAPT完全抑制表达；C组色带均比A组深，说明随着年龄增大，4种蛋白表达量均增加；C组、D组、E组的4种蛋白色带依次逐渐变浅，且Notch1、Jagged1、RBP-Jκ在E组色带接近甚至比A组浅，Hes1在E组色带甚至和A组一样几乎不显示，说明DAPT阻断Notch通路后，补益营卫方可以抑制衰老小鼠表皮干细胞中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1蛋白的表达，见图1。

图1 Western印迹检测各组Notch1、Hes1、Jagged1、 RBP-Jκ蛋白表达

3 讨 论

皮肤组织具有较强的再生能力，其外层的表皮终身不断自我更新，而表皮干细胞的无限增殖和分化，是表皮组织结构更新的基础。表皮干细胞在皮肤组织的自我更替及维护机体内环境稳态中发挥着重要作用〔6〕。当皮肤衰老时，干细胞会发生功能的异常变化及异常的增殖、分化。表皮干细胞的增殖与分化不但为自身基因所预先设置，而且会受到干细胞“壁龛”的调控〔7〕。Notch家族参与调节细胞分化、增殖、黏附、迁移及血管生成，在胚胎发育及组织稳态中发挥重要作用〔8〕。Notch信号通路由Notch受体、Notch配体及细胞内效应器分子CSL DNA结合蛋白(CBF-1/Suppresor of Hairless/LAG1的合称)3部分组成〔9〕。在哺乳动物中共发现4类Notch基因，分别为Notch1～4〔10〕。其中Notch1是高度保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白，作为Notch信号通路最主要的受体之一，Notch1的表达水平与细胞增殖关系密切，且与转录调控因子相互作用，对细胞的最终结局有影响〔11，12〕。Hes1是Notch信号转导靶基因之一，是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，通过抑制p27和p21等细胞周期抑制剂，发挥促进增殖的作用〔13〕。目前在哺乳动物中发现5种Notch配体：Delta-like(DLL)1、DLL3、DLL4及Jagged1、Jagged2。其中Jagged1是哺乳动物中第1个被证实的Notch受体的配体，Jagged1受体在皮肤全层均有表达〔7，14〕。细胞内效应器分子，即CSL DNA结合蛋白，在哺乳动物中称为RBP-Jκ〔15〕，是Notch信号通路中发挥关键作用的转录调节因子。CBF-1/RBP-Jκ自身就是1个转录抑制因子，可以特异性地与DNA序列“CGTGGGAA”结合，并招募SMRT、SKIP、Ⅰ/Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶等蛋白形成共抑制复合物，对下游基因的转录起到抑制作用。DAPT是一种新型的γ-分泌酶抑制剂，能够有效抑制细胞膜表面γ-分泌酶的活性，继而阻断Notch信号活化过程中的S3剪切，阻止受体胞内段的产生，使Notch受体分子无法进一步转变成有效的活性片段，是Notch信号转导途径的特异性阻断剂〔16，17〕。许多研究表明，Notch信号通路在增殖分化过程中起到关键性作用。它参与了间质干细胞、胚胎干细胞、表皮干细胞、肿瘤干细胞等多种干细胞的分化。有文献表明，持续表达的Hes1通过抑制DLL1及Jagged1配体抑制Notch通路，从而抑制胚胎干细胞向神经细胞分化〔18〕。Lowell等〔19〕研究发现高水平表达Deltal的表皮干细胞，对邻近细胞的Deltal配体不敏感，从而阻断Notch信号的转导，加强了干细胞簇的黏附，干细胞得以保护，同时干细胞通过自身高水平Deltal激活周边细胞的Notch信号，使之分化成短暂扩充细胞。说明阻断Notch通路可以维持表皮干细胞的特性，阻止其向表皮细胞分化。反之，增强Notch通路则可促进分化〔20〕。研究发现，Notch抑制还会减少角膜缘上皮干细胞的分化和增殖，而Notch激活可促进其分化和增殖〔21〕。

本研究结果说明，Notch信号通路中的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1表达量与表皮干细胞的分化有关，老鼠年龄越大，表皮干细胞向表皮细胞的分化越多，表明表皮干细胞的特性发生异常可能是导致皮肤衰老的原因之一；经DAPT阻断Notch通路后，结果说明补益营卫方可以通过降低Notch信号通路中Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1基因及蛋白表达水平，抑制表皮干细胞分化，维持表皮干细胞活性，阻止其向表皮细胞分化。《内经》认为，营卫和谐是人体生命活动运行的基础，与皮肤的生理病理及衰老密切相关。营卫的盛衰是影响皮肤状态的重要因素。补益营卫方中人参补营卫之气；生黄芪益气固卫，炙甘草益气调和诸药，三药合用，共奏补益营卫之功。研究发现，补益营卫方可以抑制衰老皮肤表皮细胞的凋亡〔22〕，提高表皮干细胞活性，对衰老皮肤表皮稳态有促进作用〔23〕。

综上，补益营卫方联合DAPT可以有效抑制Notch通路的活性，而抑制Notch信号通路有利于延缓皮肤衰老。补益营卫方延缓皮肤衰老的机制很可能与有效抑制衰老皮肤表皮干细胞Notch信号通路中的Notch1、Jagged1、RBP-Jκ和Hes1基因及蛋白表达水平密切相关。