山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521乳酸脱氢酶基因的克隆表达及其编码氨基酸的生物学分析

刘 威，蒋鹏程,2，杨克礼，袁芳艳，周丹娜，刘泽文，高 婷，郭 锐，孙 裴，田永祥*

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/农业农村部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室/ 畜禽病原微生物学湖北省重点实验室，湖北武汉 430064；2.安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036)

山羊传染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuro pneumonia,CCPP)是山羊的一种急性或慢性高度接触性传染病，感染羊常发生高热、胸外膜炎和纤维素性肺炎等症状[1-2]，世界动物卫生组织(WOAH)将其列为法定报告动物传染病[3]。山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)是引起CCPP的常见病原体之一[4]。Mccp最早在肯尼亚从急性感染胸膜肺炎的山羊中被分离得到[5]，随后阿曼、阿联酋、埃塞俄比亚、尼日尔、突尼斯、土耳其、苏丹、乍得等国家均报道成功分离Mccp，我国2007年首次成功分离，用病原学方法证实为 CCPP 病原[6]。近年在我国河南、新疆、黑龙江、甘肃、内蒙古、湖北等16个省或自治区均报道有CCPP病例，是影响我国山羊产业发展的重大疾病之一[7-8]。

山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体丝状亚种SC型、山羊支原体山羊亚种、丝状支原体丝状亚种LC型和丝状支原体山羊亚种均属于丝状支原体簇，簇成员之间血清学性质相似，引起的临床症状也十分类似[9-14]。针对该病病原复杂、临床鉴别难的特点，建立一种敏感、特异的Mccp检测方法尤为重要，诊断靶标的挖掘是检测方法建立的关键。研究表明，猪肺炎支原体P36乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase，LDH)蛋白存在决定种属特异性的抗原决定簇[15]，是猪肺炎支原体的一个重要诊断靶标，广泛应用在猪肺炎支原体的血清学诊断方法中。研究表明，利用P36建立的猪肺炎支原体血清学检测方法，在检测猪絮状支原体、猪鼻支原体、猪圆环病毒时不存在交叉反应[16]，抗P36的多克隆抗体与近源菌株也没有交叉反应，表现出了很高的种属特异性[17]。山羊支原体山羊肺炎亚种的LDH还未见报道。本研究以编码Mccp LDH的MCCG-0521基因为研究对象，拟采用生物信息学方法分析Mccp LDH的特性，对LDH基因进行密码子优化后构建LDH的原核表达载体，以期获得LDH的原核表达产物，为进一步研究其功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、基因组DNA及载体 大肠埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)、Rosetta，天根生化科技(北京)有限公司产品；原核表达质粒pET-30a(+)由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所兽医室保存；山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)87001基因组DNA由中国兽医药品监察所惠赠。

1.1.2 主要试剂 羊抗鼠IgG和鼠源抗His-tag单克隆抗体，武汉三鹰生物技术有限公司产品；ECL底物化学发光显色试剂，Thermo公司产品；Ni-NTA Agarose，GE公司产品；快速定点突变试剂盒、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；DNA聚合酶、T4连接酶、核酸内切酶，TaKaRa公司产品；引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.1.3 主要仪器 电泳仪(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司产品；超低温冰箱(DW-86L626)，青岛海尔股份有限公司产品；超净台(SW-CJ-1FD)，上海龙跃仪器设备有限公司产品；超高压低温细胞破碎仪(JN-MINI)，广州聚能公司产品；凝胶成像系统(GenoSens1880)，上海勤翔科学仪器有限公司；制冰机(SIM-F140LADL)，大连松下电器公司产品；梯度PCR 仪(SimpliAmp)，ABI公司产品；高速低温离心机(5810R)，德国 Eppendorf 公司产品；凝胶成像分析系统(GelDocTMXR)，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 Mccp87001株LDH基因在NCBI中的登陆号为AJK51481.1，LDH的跨膜区域为7-29位氨基酸，因此PCR扩增引物根据其胞外区核酸序列(88 bp-951 bp)设计。上游引物LDH-F为：5′-TCTGGATCCATGGCAGAACACTATGT-3′，引入BamHⅠ酶切位点；下游引物LDH-R为：5′-CTCGTCGACTTATTAAAATAAATGTTTAAC-3′，引入SalⅠ酶切位点。

1.2.2 重组表达载体的构建 以山羊支原体山羊肺炎亚种87001株基因组DNA为模板，用Primer Star DNA聚合酶对LDH基因的胞外区进行PCR扩增。PCR扩增程序为：98℃ 5 min；98℃ 10 s,51℃ 15 s,72℃ 1min,35个循环；72℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳后，将大小正确的PCR条带切胶后，通过DNA回收试剂盒进行回收与纯化。

用BamHⅠ和SalⅠ分别对pET-30a(+)载体和上述纯化的PCR产物进行双酶切，回收载体骨架和目的基因片段，并用T4连接酶于4℃连接过夜，转化DH5α，对提取的重组质粒进行测序，测序鉴定无误的重组质粒命名为pET30a-LDH。

1.2.3 LDH的密码子改造 UGA在支原体中翻译为色氨酸，而在大肠埃希氏菌中却翻译为终止密码子。用Atermis可视化软件对LDH的密码子进行分析，在LDH基因中发现了3处UGA,设计3对引物(表1)，并用定点突变试剂盒进行LDH的密码子改造，改造后的重组质粒命名为pET30a-△LDH。

表1 LDH基因密码子改造的引物序列

1.2.4 pET30a-△LDH的诱导表达及目的蛋白纯化 将pET30a-△LDH转化E.coliBL21 (DE3)或Rosetta感受态细胞中，置于37℃培养箱中，当培养物OD600nm值达到0.6时，利用IPTG进行诱导表达，诱导条件为37℃诱导表达4 h或22℃诱导16 h，同时设置空载体和未诱导对照组。SDS-PAGE检测重组质粒表达情况。

pET30a-△LDH经IPTG诱导成功表达后，12 000 r/min离心10 min收集菌体，采用高压细胞破碎仪破碎菌体，离心后沉淀通过尿素溶解，并与Ni-NTA Agarose混匀，过柱纯化，用不同浓度的咪唑洗脱，洗脱液用SDS-PAGE检测。纯化后蛋白置于0.01 mol/L PBST (pH 8.0)中，于4℃透析，透析过程中通过磁力搅拌棒持续搅拌促进溶液交换，并隔段时间更换洗脱液，透析完成后将蛋白保存在-80℃冰箱备用。

1.2.5 Western blot验证 LDH蛋白通过SDS-PAGE分离后，利用Western blot转膜仪器转印至PVDF膜上，PBST洗5次，每次3 min，随后用10 mL 30 g/L脱脂奶粉封闭，一抗采用鼠源anti-His tag的单克隆抗体(1∶5 000稀释，37℃孵育1 h)，二抗用HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶5 000稀释，37℃孵育1 h)，PBST洗膜5次，每次3 min，去除未结合的抗体，并使用底物化学发光ECL显色和图像获取。

2 结果

2.1 LDH蛋白序列生物信息学分析

用TMHMM-2.0分析了LDH蛋白的跨膜区，结果显示LDH的胞外区为1-6位氨基酸、跨膜区为7-29位氨基酸、胞外区为30-317位氨基酸(图1)。用SignalP -5.0分析了LDH的信号肽区域，结果显示LDH的信号肽位于1-23位氨基酸(图2)。采用NetOGlyc-4.0分析了LDH胞外区的O-糖基化位点，结果表明LDH存在3处潜在的O-糖基化位点，位于第22、26、108位氨基酸。

图1 LDH蛋白跨膜区预测结果

图2 LDH蛋白信号肽预测结果

2.2 pET30a-LDH重组载体的构建及密码子改造

以山羊支原体山羊肺炎亚种87001株基因组DNA为模板，用Primer Star DNA聚合酶对LDH基因的胞外区进行PCR扩增，将其连接至pET-30a(+)载体，构建重组质粒pET30a-LDH，序列测定分析后证实重组质粒构建正确。针对LDH基因中的3处TGA通过快速定点突变试剂盒依次将其突变为TGG。密码子改造后的重组质粒进行核酸序列测定，测序结果证实LDH中473、761、779 nt处的A成功突变为G(图3)，该重组质粒命名为pET30a-△LDH。

图3 密码子改造前后的序列比对

2.3 LDH融合蛋白的诱导表达

pET30a-△LDH经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析表达情况，结果显示,pET30a-△LDH转化Rosetta感受态细胞，在37℃诱导4 h和22℃诱导16 h条件下，在约34 ku处均可见一条蛋白条带，蛋白大小与理论值一致，表明密码子改造后的pET30a-△LDH在大肠埃希氏菌 Rosetta中成功表达；而pET30a-△LDH转化BL21感受态细胞后，在37℃诱导4 h和22℃诱导16 h后均未见目的蛋白的表达(图4)。

2.4 融合蛋白的纯化

pET30a-△LDH经IPTG诱导表达后，采用Ni-NTA Agarose过柱纯化，不同浓度咪唑的洗脱产物用SDS-PAGE跑胶检测，经PBST透析和蔗糖浓缩后获得纯化的LDH蛋白(蛋白浓度为0.75 mg/mL，大小约为34 ku)，置-80℃保存，用于后续功能的研究(图5A)。

以鼠源anti-His tag的单克隆抗体(1∶5 000稀释)为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)为二抗，Western blot结果显示，在约34 ku处有一条蛋白条带，蛋白大小与预期一致(图5B)。

A.LDH蛋白的纯化；M.蛋白分子质量标准；1.Ni2+柱亲和层析纯化后的蛋白；B.Western blot验证；M.蛋白分子质量标准；1.pET30a-△LDH诱导3 h；2.pET30a诱导3 h

2.5 LDH主要抗原域预测

用Jameson-Wolf对LDH胞外区的288个氨基酸进行抗原域的预测，结果表明LDH的主要抗原域位于：Phe9-Leu18、Ile34-Val47、Thr51-Ala70、Glu71-Gly87、Thr119-Gly131、Leu134-Ala143、Glu148-Val154、Glu179-Ala192、Val217-Leu225、Leu231-Tyr241、Asp260-Val283(图6)。

2.6 LDH的二级结构预测

用DNAStarProtean对LDH胞外区的288个氨基酸进行二级结构的预测。Chou-Fasman法共预测了9个α螺旋中心，12个β折叠区段，19个T转角区段；Garnier-Robson法共预测了13个α螺旋中心，20个β折叠区段，6个T转角区段。Chou-Fasman和Gamier-Robson同时预测的α螺旋中心有8处，即Asn16-Asp9、Glu60-Met65、Ala70-Val80、Ala124-Leu126、Leu178-Ile184、Val189-Ala192、Glu221-Leu231、Ile2571-Phe269；同时预测的β折叠区段有12处。蛋白骨架的柔性区域，用Karplus-Schulz法进行预测，结果表明LDH有16处柔性区域，同时用Emini方法分析了LDH中特定区域位于表面的可能性(图6)。

Alpha helix：α螺旋；Beta-pleated sheet：β折叠；Turn：T转角；Flexible regions：柔性区域；Antigenic index：主要抗原域；Surface probability：表面可及性

3 讨论

支原体相对病毒和细菌而言整体研究相对滞后，其密码子使用与常规表达系统存在差异，给支原体功能基因的研究造成了阻碍。L-乳酸脱氢酶是L-lactate dehydrogenase基因编码的产物，研究表明，猪肺炎支原体的L-乳酸脱氢酶具有种属特异性的抗原决定簇[17]，是其重要的诊断靶标，广泛应用在猪肺炎支原体的血清学检测方法中。然而，山羊支原体山羊肺炎亚种的LDH还未见报道。基因表达产物的成功获得是进一步研究其功能的前提，然而UGA在支原体中翻译为色氨酸，在大肠埃希氏菌中为终止密码子，导致含有UGA密码子的支原体基因在大肠埃希氏菌中无法正确表达，给基因功能的研究造成了阻碍。

本研究以Mccp的MCCG-0521 LDH为研究对象，通过生物信息学方法，分析了其跨膜区、信号肽等，并选取其胞外区进行原核表达。在完成了基因的克隆后，我们将LDH中的3处TGA进行了定点突变，使TGA突变为TGG，以期使LDH基因能在大肠埃希氏菌BL21 (DE3)或Rosetta中正确表达。在原核表达时，我们首先将重组质粒pET30a-△LDH转化入E.coliBL21 (DE3)中，然而经过IPTG诱导后，SDS-PAGE并未检测到目的条带。随后，我们尝试了E.coliRosetta菌株，结果显示重组质粒转化Rosetta感受态细胞后，37℃诱导表达4 h以及22℃诱导表达16 h后，出现了一条约34 ku的条带，大小与预期一致。Western blot进一步证实LDH在大肠埃希氏菌系统中正确表达。

B细胞抗原受体或抗体可以特异性识别和结合抗原中的线性片段或空间构象性结构，该线性片段或空间构象性结构称为B细胞表位。研究表明，转角和无规则卷曲区域常位于蛋白的表面，易与抗体结合，B细胞表位位于这些区域的可能性较大[18]。通过分析LDH蛋白的转角、无规则卷曲、亲水性区域、柔性区域，预测了LDH可能的B细胞表位，结果显示该蛋白的B细胞表位极可能位于Pro10-Glu14、Gly37-Cys42、Gly53-Leu63、Thr78-Gly84、Leu134-Ser140、Gln183-Val189、Arg219-Ala223、Leu231-Tyr241、Asp260-Asp270这些区段。综上所述，本研究以山羊支原体山羊肺炎亚种MCCG-0521基因为研究对象，通过定点突变技术完成了该基因的密码子改造，使其具备在大肠埃希氏菌系统中表达的可能，随后通过不同感受态细胞的筛选以及诱导条件的摸索，最终获得了MCCG-0521基因的体外表达产物，分析了其编码氨基酸的二级结构和可能的B细胞抗原优势表位，LDH表达产物的成功获得为进一步研究其功能奠定了基础。