猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型和3型多重荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

肖 婷，何 颖，赵 硕，蒋家霞，陈忠伟，郭 旋，卢冰霞，林昌华，赵 武，秦毅斌，段群棚，全琛宇，许心婷，陈婷婷，许艺兰，胡庭俊，张 宁,6*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001；3.广西农垦永新畜牧集团新兴有限公司，广西柳州 545000；4.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，广西南宁 530042；5.广西农垦永新畜牧集团西江有限公司，广西贵港 537100；6.广西桂垦牧业有限公司，广西南宁 530022)

猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性呼吸道疾病，具有持续周期长、难治愈、易出现免疫抑制而诱发患病猪继发感染其他病原[1]，如猪圆环病毒、多杀性巴氏杆菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒等[2]，使病原感染的程度进一步严重，造成较高的病死率，导致养猪业的巨大经济损失。猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科、圆环病毒属的一种呈球形、无囊膜的单股负链环状DNA病毒，是目前已知的具有自主复制能力的最小的动物病毒[3]。PCV2(Porcine circovirus 2，PCV2)首次报道于1997年，能够引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrom，PMWS)、猪皮炎肾病综合征(Porcine dermatitis nephropathy syndrome，PDNS)和繁殖障碍等猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)[4]。2016年，PCV3(Porcine circovirus 3，PCV3)从患有PDNS、繁殖障碍的母猪和关节肿胀、消瘦等疾病的母猪或仔猪中分别被检测到[5]。临床上PCV2和PCV3常以混合感染的方式感染猪群，且症状相似，难以区分[6]。

近年对Mhp、PCV2和PCV3的检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、分离培养等方法和普通PCR及荧光定量PCR等分子生物学方法[2,5]。这些方法主要存在耗时长、操作繁琐、不能同时鉴别多种病原、敏感性较低及较难分离培养等问题[2,7]，不利于快速鉴别诊断日趋复杂的混合病原体感染。多重荧光定量PCR是一种具有较高特异性、灵敏性和精确性的实时定量检测特定核酸的技术，可同时鉴别检测多种病原，缩短检测时间，降低检测成本。Mhp、PCV2和PCV3感染均可引起呼吸系统疾病，且症状相似，临床上很难直接区分这3种病原是单一感染还是混合感染。本文建立了可同时检测Mhp、PCV2和PCV3的多重荧光定量PCR检测方法，并以β-Actin作为内参基因，为上述病原的临床快速检测以及流行病学调查奠定了技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、疫苗毒株及临床样品 本研究所用的猪肺炎支原体(J株)疫苗、PCV2、PCV3、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea，PEDV)、传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine，TGEV)、猪口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)及临床表现呼吸道疫病症状的猪临床病料样品，均由广西壮族自治区兽医研究所病毒研究室于-80℃保存。

1.1.2 主要试剂 大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞、pMD18-T Vector、2×TaqMan Fast qPCR预混液,生工生物工程(上海)股份有限公司产品；病毒基因组DNA/RNA快速抽提试剂盒,Axygen生物科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000,Takara生物技术有限公司产品；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒,OMEGA公司产品；其他试剂均为分析纯级别试剂。

1.1.3 主要仪器设备 QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪,美国赛默飞公司产品；凝胶成像系统,美国Bio-rad公司产品；电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司产品；台式高速离心机，德国Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针合成 Mhp引物参照文献[8]，根据GenBank收录的PCV2、PCV3和β-Actin基因序列，应用Primer 5.0软件针对保守序列区域设计特异性的引物及探针(表1)。引物及探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 Mhp、PCV2、PCV3和β-Actin的引物与探针序列

1.2.2 核酸提取 按照抽提试剂盒的操作说明抽提样品核酸，所提取的核酸置-80℃保存备用。使用同样方法提取收集猪的组织临床样品核酸，置-80℃保存备用。

1.2.3 阳性标准品构建 对选定的Mhp、PCV2、PCV3和β-Actin的保守基因引物序列为：Mhp(F：5′-GCCTTGGTATGACTGGATCTC-3′，R：5′-CG CGAAATCCTGAGGATTTAG-3′)；PCV2(F：5′-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3′，R：5′-ACCCCC GCCACCGCTACC-3′)；PCV3(F：5′-TTACTTAGAGAACGGACTTGTAACG-3′，R：5′-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3′)；β-Actin(F：5′-CTCCATCATGAAGTGCGACGT-3′，R：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′)。PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环；72℃终延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳试验鉴定条带大小正确后，将产物回收纯化，连接pMD18-T载体并转化感受态细胞大肠埃希氏菌DH5α，经培养后挑取单菌落，筛选出阳性重组质粒进行测序，测序正确的阳性重组质粒作为标准品，分别命名为pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin，于-20℃保存备用。根据质粒浓度计算出pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin的拷贝数分别为2.64×1010、6.66×109、2.56×1010、5.99×109copies/μL。

1.2.4 多重荧光定量PCR方法建立与优化 在已建立的单项Mhp、PCV2、PCV3和β-Actin荧光定量PCR方法基础上对20 μL反应体系的混合引物和探针浓度及退火延伸温度做进一步优化，以筛选最适反应体系和反应条件。

1.2.5 标准曲线的建立 对pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin进行10倍倍比稀释，按1.2.4优化的反应条件对各稀释度的质粒标准品进行PCR扩增，反应结束后以Ct值为横坐标、各重组质粒起始拷贝数浓度的对数为纵坐标，绘制4个标准品的标准曲线。

1.2.6 特异性试验 以PRV、PPV的DNA，PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV、FMDV的cDNA为模板，以pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3为阳性对照，DEPC水为空白对照，用优化的多重荧光定量PCR条件进行特异性试验。

1.2.7 敏感性试验 将pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin分别进行10倍倍比稀释，按优化的荧光定量PCR反应条件进行试验，同时进行普通PCR扩增，以确定该荧光定量PCR方法与常规PCR方法的敏感性差异。

1.2.8 重复性试验 选取3个浓度的pMD18-T-Mhp(2.64×104copies/μL～2.64×106copies/μL)、pMD18-T-PCV2(6.67×104copies/μL～6.67×106copies/μL)、pMD18-T-PCV3(2.57×104copies/μL～2.57×106copies/μL)、pMD18-T-β-Actin(5.99×104copies/μL～5.99×106copies/μL)为模板，进行重复试验，以评价该方法组内和组间的重复性。

1.2.9 多重荧光定量PCR的临床应用 应用建立的多重荧光定量PCR方法和普通PCR方法对本中心收集的101例猪临床样品进行检测，设置pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin为阳性对照，DEPC水作为阴性对照，计算两种方法的符合性。

2 结果

2.1 多重荧光定量PCR方法建立与优化

完成退火温度和引物探针配比优化，确定本方法20 μL反应体系：2×TaqMan Fast qPCR 10 μL，4条TaqMan探针各0.1 μL(10 μmol/L)，8条引物各0.25 μL(10 μmol/L)，核酸模板4 μL，DEPC水4.4 μL。 扩增参数：94℃ 3 min；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。

2.2 标准曲线的建立

对pMD18-T-Mhp定量检测范围为2.64×102copies/μL～2.64×107copies/μL，相关系数(R2)为0.9992。对pMD18-T-PCV2定量检测范围为6.67×102copies/μL～6.67×107copies/μL，相关系数(R2)为0.9981。对pMD18-T-PCV3定量检测范围为2.57×102copies/μL～2.57×107copies/μL，相关系数(R2)为0.9923。对pMD18-T-β-Actin定量检测范围为5.99×103copies/μL～5.99×107copies/μL，相关系数(R2)为0.9951(图1)。

A.pMD18-T-Mhp(2.64×102 copies/μL～2.64×107 copies/μL)标准曲线；B.pMD18-T-PCV2(6.67×102 copies/μL～6.67×107 copies/μL)标准曲线；C.pMD18-T-PCV3(2.57×102 copies/μL～2.57×107 copies/μL)标准曲线；D.pMD18-T-β-Actin(5.99×103 copies/μL～5.99×107 copies/μL)标准曲线

2.3 特异性试验

用本研究建立的方法对PRRSV、CSFV、PRV、JEV、PPV、PEDV、TGEV、FMDV等核酸进行特异性试验。结果显示，只有pMD18-T-Mhp模板在反应后收集到“FAM”荧光信号，pMD18-T-PCV2模板在反应后收集到“CY5”荧光信号，pMD18-T-PCV3模板在反应后收集到“VIC”荧光信号，所有病原核酸在反应后收集到“ROX”荧光信号，且随着反应进行，荧光信号不断增强，均出现典型的“S”型扩增曲线；其他猪病病原核酸模板和空白对照在“FAM”、“VIC”和“CY5”通道均无扩增荧光曲线(图2)。表明该方法特异性强，能准确鉴别检测Mhp、PCV2和PCV3，检测其他病原核酸无交叉反应。

1.Mhp；2.PCV2；3.PCV3；4～11.PRRSV、CSFV、PRV、JEV、PPV、PEDV、TGEV、FMDV；12.阴性对照

2.4 敏感性试验

用本研究建立的多重荧光定量PCR方法及普通PCR方法对经10倍倍比稀释的pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin标准品模板进行扩增。结果显示，pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin标准品对应的最低检测拷贝数分别为26.4 copies/μL、66.7 copies/μL、25.6 copies/μL和5.99×103copies/μL，比相应的常规PCR方法的敏感性分别提高了10 000倍、10 000倍、10 000倍和100倍(图3～图6)。

M.DNA标准DL 2 000; 1～8.重组质粒浓度分别为2.64×107 copies/μL～2.64×100 copies/μL;N.阴性对照

M.DNA标准DL 2 000; 1～9重组质粒浓度分别为6.67×108 copies/μL～6.67×100 copies/μL;N.阴性对照

M.DNA标准DL 2 000; 1～8.重组质粒浓度分别为2.56×107 copies/μL～2.56×100 copies/μL;N.阴性对照

M.DNA标准DL 2 000; 1～8.重组质粒浓度分别为5.99×107 copies/μL～5.99×100 copies/μL;N.阴性对照

2.5 重复性试验

按照已优化的反应条件，选择3个稀释度的pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin标准品为模板进行测试。对每个稀释度的模板分别进行3次批内和批间重复检测，结果显示，不同浓度同一模板检测结果的批内和批间变异系数均在2%以内(表2)，表明所建的荧光定量PCR方法具有良好的重复性和稳定性，能够满足临床检测需要。

表2 多重荧光定量PCR重复性试验结果

2.6 临床样本检测结果

应用建立的多重荧光定量PCR方法和常规PCR方法，对实验室收集灭活的101份猪临床样品进行检测，分别以pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin为阳性对照。结果显示，检出Mhp阳性21份，PCV2阳性37份，PCV3阳性34份，阳性率分别为20.8%、36.6%和33.7%。Mhp和PCV2、PCV3的混合感染样品分别有14份和5份，PCV2和PCV3均呈阳性样品有8份，有3份样品检测结果三者均呈阳性，阳性对照出现典型的扩增曲线，与普通PCR法检测结果一致。

3 讨论

随着中国养猪业规模化、集约化发展，猪病的发生和流行对养猪生产的危害日趋加重，多病原混合感染已成为当前猪群疫病流行的主要形式与特点[9]。猪支原体肺炎一直被认为是最常见、流行最广、最难净化的重要疫病之一，猪圆环病毒2型感染是全球公认的危害养猪业的重大经济影响性疾病，被称为猪的“艾滋病”[10]，PCV3是一种新发猪病毒性传染病病原，近年来在国内外广泛流行，严重影响我国甚至世界各国养猪产业的持续健康发展[11]。 Mhp、PCV2和PCV3均可引起呼吸系统疾病，PCV2和Mhp的混合感染是猪呼吸道病综合征主要的表现形式之一[12]。在山西省猪呼吸道疾病综合征病原感染调查中发现,Mhp与病毒混合感染的阳性率为74.7%，主要为Mhp+PCV3或Mhp+PCV2+PCV3混合感染，临床上难以区分这3种病原是单一感染还是混合感染[13]。Mhp、PCV2和PCV3多重荧光PCR检测方法的建立有利于临床上对感染发病及处于亚临床状态生猪的早期诊断，早发现早治疗能大大减少因Mhp、PCV2和PCV3暴发感染导致的猪场经济损失。

国内外研究人员已建立了多种单病原或多病原荧光PCR检测技术[5，14-16]，但尚未检索到多重荧光定量PCR方法同时区分Mhp、PCV2和PCV3的报道。本研究为了解决Mhp、PCV2和PCV3感染后症状相似且常发生混合感染，不易鉴别的问题，选择Mhp、PCV2和PCV3基因序列的保守区域，通过大量试验筛选特异性的引物和探针，建立了以β-actin作为内参基因鉴别检测Mhp、PCV2和PCV3的多重荧光定量PCR方法。结果表明，本研究建立的多重荧光定量PCR方法可实现Mhp、PCV2和PCV3的鉴别检测，其相关系数(R2)分别为0.999、0.998和0.992，检测常见猪疫病病毒基因组无交叉反应；应用该方法最低可检测到26.5 copies/μL(Mhp)、66.7 copies/μL(PCV2)和25.7 copies/μL(PCV3)的病毒核酸，灵敏度较高，其最低检测限高于郭慧娟等[17]建立的PCV2TaqMan荧光定量PCR检测方法的灵敏度，与吴江等[18]建立的PCV2、PCV3双重荧光定量检测方法灵敏度相当，Mhp引物与探针序列引用自武昱孜[8]，最低限度较其略高但差距不大，可能是试验环境等差异导致，因此该方法可用于Mhp、PCV2和PCV3感染早期的病原鉴别检测，实现Mhp、PCV2和PCV3同时定性、定量检测，亦可应用在Mhp、PCV2和PCV3在猪体内不同组织器官中分布情况及病毒载量的研究。

将本研究建立的多重荧光定量PCR方法与普通PCR检测方法进行符合率分析，所有临床样品的两者检测结果一致，与预期相符。在101个临床样品中，Mhp、PCV2和PCV3阳性病例较多，阳性率高达20.8%、36.6%和33.7%，Mhp和PCV2、PCV3的混合感染率分别为13.9%和4.9%，PCV2和PCV3的混合感染率为7.9%，样品中共有3份样品三者均呈阳性。说明疫苗的大规模推广使用依然不能彻底控制这3种疫病的发生，三者之间相互都存在混合感染，意味着猪群感染Mhp、PCV2和PCV3的问题不应该被忽视，在猪群中同时检测和区分这3种病原是非常有必要的。本方法的建立为鉴别和监测Mhp、PCV2和PCV3在猪群的感染情况提供了重要的技术手段。

本研究成功地建立了一种能同时检测和鉴别Mhp、PCV2和PCV3的多重TaqMan荧光定量PCR方法，反应时间约45min，可进行大批量样品的快速检测，大大缩短了检测时间，提高了检测效率。因为该方法在临床样品检测中具有敏感、特异和准确等特点，适合于Mhp、PCV2和PCV3单独或混合感染的早期诊断、疫病筛查及流行病学调查，以便及时采取防控措施，为控制Mhp、PCV2和PCV3感染提供了有效的技术支持。