热休克蛋白HSP90B1影响牛病毒性腹泻病毒复制的研究

陈俊贞，权 冉，付 强，葛丽娟，袁圆圆，张成远，李建林，史慧君

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)与猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、羊边界病病毒(border disease virus，BDV)同属于黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(Pesztivirus)[1]，是牛病毒性腹泻/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)的主要病原，易感动物有牛、羊、骆驼等[2]。BVDV感染后会损伤机体的呼吸和生殖系统[3]，且病毒会攻击免疫系统，使机体产生免疫抑制[4]，随后出现继发感染，对组织、器官等造成严重损伤。近年来，随着畜牧业的快速发展，进出口运输频繁，促进了BVDV的传播，对畜牧养殖业的健康发展造成严重危害，并且对相关生物制品的安全性产生了不利影响。BVDV病毒的致病机制复杂，感染范围较广[5]，明确该病毒的感染机制可以为预防和治疗BVD提供高效的方法和新的思路。

热休克蛋白90 β家族成员1(heat shock protein 90 beta family member 1，HSP90B1)是一种由内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)诱导的蛋白[6]，属于热休克蛋白90(heat shock protein 90 kDa，HSP90)家族，在蛋白折叠和质量控制中发挥关键作用[7]，对Ca2+稳态、ERS以及宿主防御有重要影响[7-8]。HSP90家族的分子伴侣活性对于病毒蛋白的组装、成熟和维持都有重要作用，如在麻疹和尼帕病毒的L聚合酶折叠中的作用[9]，并且能够参与到柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒和鼻病毒等小核糖核酸病毒的衣壳加工和组装[10]。有研究显示，调控HSP90B1表达可以抑制黄病毒的复制，包括登革热病毒和寨卡病毒[11]，能够导致人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染细胞中CD4受体的表达显著增加[12]，HSP90B1蛋白表达的差异可能是PEDV致病性差异的原因之一[13]，还有研究发现病毒糖蛋白E2能够激活ERS反应并诱导HSP90B1的转录，敲低HSP90B1能够抵消E2的抗细胞凋亡作用[14]。课题组以往研究使用BVDV感染胎牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney，MDBK)细胞后进行蛋白组学分析，结果与空白组相比HSP90B1极显著性差异表达，以此推测HSP90B1可能是影响BVDV复制的关键基因之一，使用BVDV感染MDBK细胞后，通过蛋白和mRNA水平检测了HSP90B1的表达，再利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除MDBK细胞的HSP90B1基因，构建HSP90B1 KO细胞，感染BVDV后，通过免疫荧光，qRT-PCR，病毒滴度以及CPE检测病毒的复制情况，结果显示BVDV感染MDBK细胞后，HSP90B1的蛋白水平和mRNA的转录水平均显著性上升，敲除MDBK细胞的HSP90B1基因能够显著性抑制BVDV的复制，为研究BVDV的致病机制以及BVD的综合防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、质粒及细胞

BVDV TC分离株由新疆农业大学动物医学学院传染病实验室冉多良教授惠赠[15]；pSPAX2、pMD2.G、lentiCRISPR v2、pLenti-GFP质粒购自Addgene公司；胎牛肾细胞和人胚肾293T细胞(Human embryo kidney 293T，HEK-293T)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 主要试剂

兔抗GRP94抗体(bs-0194R)购自北京博奥森生物技术有限公司；大肠杆菌Stbl3感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)购自北京天根生化科技有限公司；苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、RIPA裂解液、BeyoECL Moon化学发光试剂盒和嘌呤霉素购自上海碧云天生物技术有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、固体琼脂粉购自上海生工生物工程股份有限公司；TRIzol购自Ambion公司；高糖DMEM和胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)购自BI公司；Endofree PlasmidMiniprep Kit购自BIOMIGA公司；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)和0.25%Trypsin-EDTA购自GIBCO公司；T4 DNA Ligase和BsmBⅠ购自New England Biolabs公司；聚乙烯亚胺(Poly ethylenimine，PEI)购自Polysciences公司；GAPDH MAb、HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L)和Cy3标记山羊抗鼠IgG(H+L)购自Proteintech公司；J2 anti-dsRNA IgG2a单克隆抗体(MAb)购自Scicons公司；聚凝胺购自Sigma公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒购自TaKaRa公司。

1.3 qRT-PCR检测HSP90B1 mRNA转录水平

将MDBK细胞按3×105个·孔-1的密度接种至6 cm细胞培养皿，置于细胞培养箱中培养至汇合度约70%时，加入10 000 TCID50BVDV TC株感染细胞，分别于24、36和48 h时，加入TRIzol裂解液提取细胞和培养液的总核糖核酸(RibonucleicAcid，RNA)，测定浓度后将1 μg总RNA反转录为cDNA；以此为模板，按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)说明书配制体系[16]，qRT-PCR检测HSP90B1 mRNA的转录水平。

1.4 Western blot检测HSP90B1蛋白表达水平

将1×106个MDBK细胞接种至10 cm细胞培养皿，待细胞密度达到80%左右时，感染10 000 TCID50BVDV TC株，48 h后加入600 μL含1 mmol·L-1PMSF的RIPA裂解液提取总蛋白，测定浓度后变性60 μg总蛋白，利用Western blot检测HSP90B1蛋白含量，一抗分别为GRP94抗体(1∶1 000)和GAPDH抗体(1∶1 000)，二抗为山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)。

1.5 构建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重组质粒

根据GenBank数据库中牛源HSP90B1的基因序列(登录号：282646)，使用Benchling(www.benchling.com)和Chop-Chop(www.chopchop.cbu.uib.no)设计HSP90B1-sgRNA和Scramble序列(表1)，送至金唯智生物(苏州)科技有限公司合成；将合成的HSP90B1-sgRNA和Scramble的Forward、Reverse各取10 μL(100 μmol·L-1)，37 ℃孵育30 min，95 ℃孵育5 min后梯度降温至25 ℃(5 ℃·min-1)，合成双链sgRNA。利用限制性内切酶BsmBⅠ酶切lentiCRISPR v2质粒，利用1%琼脂糖凝胶电泳验证后，回收12 000 bp处的目的条带，将合成的双链sgRNA连接至回收的线性载体中构建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重组质粒；连接产物转化至大肠杆菌Stbl3感受态细胞，挑取单克隆菌落，对转化后的lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA菌液进行PCR和测序鉴定。

表1 sgRNA序列

1.6 HSP90B1 KO/Scramble细胞构建及检测

6 cm细胞培养皿用0.1%明胶包被30 min后，接种3×105个HEK-293T细胞，培养至汇合度约80%时，将3 μg pSPAX2、1.5 μg pMD2.G和3 μg lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA质粒在1.5 mL离心管中混匀，加入37.5 μL PEI (1 mg·mL-1)，细胞弃原培养液，加入2.5 mL DMEM和上述混合液，置于细胞培养箱中孵育3 h后更换含10% FBS的新鲜细胞培养液，置于细胞培养箱中培养48 h，收集上清液得到慢病毒HSP90B1-sgRNA和Scramble-sgRNA。同时转染pLenti-GFP质粒，包装GFP慢病毒，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，估算慢病毒包装效率。

向慢病毒HSP90B1-sgRNA和Scramble-sgRNA加入聚凝胺(终浓度为8 μg·mL-1)后悬浮感染MDBK细胞，同时设立GFP对照组以观察慢病毒感染效率；细胞培养箱中孵育24 h后更换含10% FBS的新鲜培养液，置于细胞培养箱中继续培养48 h，加入终浓度为3 μg·mL-1的嘌呤霉素，连续筛选4代获得HSP90B1 KO细胞和Scramble阳性细胞。分别收集5×106个HSP90B1 KO和Scramble细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度，检测HSP90B1的敲除效率。

1.7 细胞生长情况检测

按3×105个细胞·孔-1的密度将HSP90B1 KO、Scramble和MDBK细胞接种至6孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养，分别于接种后24、48、72、96、120 h时用0.25% Trypsin-EDTA完全消化后收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min后弃上清，加入1 mL培养液重悬细胞，显微镜下进行细胞计数。

1.8 qRT-PCR检测BVDV 5′UTR RNA水平

分别接种3×105个·孔-1HSP90B1 KO和Scramble细胞至6孔细胞培养板中，待细胞密度达到80%时，感染10 000 TCID50的BVDV TC株，于感染后12、24、36、48 h时收集细胞及培养液提取总RNA，反转录为cDNA，采用qRT-PCR检测BVDV 5′UTR RNA水平[17]。

1.9 免疫荧光检测BVDV dsRNA含量

24孔细胞培养板铺爬片并用1%明胶包被30 min，按1×105个·孔-1的密度将HSP90B1 KO和Scramble细胞接种至细胞培养板中，待细胞贴壁后感染10 000 TCID50的BVDV TC株，于感染后12、24、36、48 h后收集爬片；PBS清洗后，加入200 μL 4%多聚甲醛，室温条件下固定15 min；清洗后加入200 μL含1%山羊血清的封闭液，室温孵育1 h；清洗3次后加入J2 anti-dsRNA IgG2a单克隆抗体(1∶1 200)，4 ℃孵育过夜；清洗并加入Cy3标记山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(1∶200)，室温下避光孵育1 h；PBS清洗，滴加5 μL抗荧光猝灭封片剂，将爬片置于封闭液上进行封片；利用激光共聚焦显微镜观察荧光分布情况及强度。

1.10 BVDV感染HSP90B1 KO细胞后病毒滴度检测

以3×105个·孔-1的密度将HSP90B1 KO细胞和对照组Scramble细胞接种至6孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中静置培养；待细胞贴壁后，加入10 000 TCID50BVDV TC株感染细胞，于感染后12、24、36、48 h收集细胞和培养液，置于-80 ℃冰箱中反复冻融3次，液体转移至2 mL离心管，4 ℃ 1 000 r·min-1离心10 min，收集上清，采用Reed-Muench法测定各上清液中的病毒滴度。

1.11 BVDV感染HSP90B1 KO细胞CPE情况

按3×105个·孔-1的密度接种HSP90B1 KO和Scramble细胞至6孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养，细胞密度约70%时，接种10 000 TCID50的BVDV TC株感染细胞，于感染后12、24、36和48 h时，使用倒置显微镜(TE2000U)观察细胞病变效应(cytopathic effects，CPE)，并拍照进行对比。

1.12 统计分析

利用SPSS 19.0 for Windows(SPSS Inc. Chicago，IL，USA)对结果进行统计学分析。通过t检验确定统计学显著性(*.P<0.05；**.P<0.01)。

2 结 果

2.1 qRT-PCR检测HSP90B1 mRNA转录水平

为检测BVDV感染MDBK对HSP90B1 mRNA转录水平的影响，使用BVDV TC株感染MDBK细胞后不同时间收集细胞总RNA，反转录cDNA，进行qRT-PCR检测，结果如图1所示，与空白组相比病毒感染24 h时HSP90B1 mRNA转录水平显著升高(P<0.05)，36和48 h时极显著升高(P<0.01)，表明BVDV感染MDBK细胞导致HSP90B1 mRNA转录增加。

*. P<0.05; **. P<0.01；下同

2.2 Western blot检测HSP90B1蛋白表达

为进一步检测BVDV感染MDBK细胞对HSP90B1表达的影响，使用BVDV TC株感染MDBK细胞48 h后提取蛋白，进行Western blot检测，结果与空白组相比BVDV感染细胞后细胞中的HSP90B1蛋白表达水平明显增加(图2)，表明BVDV感染MDBK细胞使MDBK细胞内HSP90B1蛋白的表达量升高。

A. Western blot检测结果；B. 灰度值分析

2.3 lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重组质粒构建结果

为构建lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重组质粒，利用限制性内切酶BsmBⅠ酶切lentiCRISPR v2质粒，1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果显示得到两条大小不同的条带，一条在12 000 bp，一条在2 000 bp(图3)，与预期结果一致，回收12 000 bp处的目的条带，将连接构建的重组质粒lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA转化至Stbl3感受态细胞，挑取单克隆菌落PCR后，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒中HSP90B1 sgRNA 和Scramble sgRNA是否连接成功，结果在260 bp处显示条带(图4)，同时送至公司进行测序并使用Snapgene (v4.2.4)软件绘制图谱，以上结果表明lentiCRISPR v2-HSP90B1/Scramble-sgRNA重组质粒构建成功。

Marker. DL10000 bp DNA相对分子质量标准；1、2. 酶切后lentiCRISPR v2

Marker. DL500 bp DNA相对分子质量标准；1～12. lentiCRISPR v2-HSP90B1-sgRNA；13. 阴性对照

2.4 HSP90B1 KO/Scramble细胞构建及检测

为得到HSP90B1 KO/Scramble细胞，转染包装HSP90B1-sgRNA、Scramble-sgRNA和GFP慢病毒，悬浮感染MDBK细胞，使用荧光倒置显微镜观察GFP对照组的感染效率，结果在显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达量约为50%，表明感染效率为50%(图5)；加入终浓度为3 μg·mL-1的嘌呤霉素，连续筛选4代获得阳性细胞，提取细胞总蛋白，进行Western blot，结果与对照组相比HSP90B1蛋白的表达量明显降低(图6)，表明HSP90B1 KO细胞构建成功。

A. 明场下HEK-293T；B. 荧光通路下HEK-293T；C. 合并图。扫描文章首页OSID码可查看彩图

A. Western blot检测结果；B. 灰度值分析

2.5 细胞生长情况检测

为检测敲除HSP90B1基因对细胞生长的影响，将相同数量的不同细胞接种至6孔细胞培养板中，分时间段利用0.25%Trypsin-EDTA消化后，进行细胞计数，结果显示相同时间的Scramble、HSP90B1 KO细胞的数量与MDBK细胞相比未见差异(图7)，表明敲除HSP90B1对于细胞的生长没有影响。

图7 细胞生长情况检测结果

2.6 qRT-PCR检测BVDV 5′UTR RNA水平

为检测HSP90B1对BVDV 5′UTR RNA表达的影响，于BVDV感染后不同时间收集细胞及培养液，提取总RNA，应用qRT-PCR检测BVDV 5′UTR RNA水平，结果如图8所示，与对照组Scramble细胞相比，病毒感染HSP90B1 KO细胞12 h后BVDV 5′UTR RNA水平显著降低(P<0.05)，感染36 h后极显著性降低(P<0.01)，表明敲除HSP90B1基因会抑制BVDV 5′UTR RNA的表达水平。

图8 qRT-PCR检测BVDV感染HSP90B1 KO细胞中BVDV 5′UTR RNA

2.7 免疫荧光检测BVDV dsRNA含量

为明确HSP90B1对BVDV dsRNA在细胞中形成的影响，BVDV感染HSP90B1 KO和Scramble细胞后不同时间收集细胞爬片，利用激光共聚焦显微镜观察荧光分布及强度，结果BVDV dsRNA呈现绿色荧光，细胞核显示红色荧光。与对照组相比，HSP90B1 KO细胞中的绿色荧光明显减少(图9)，表明敲除HSP90B1能够减少BVDV dsRNA在细胞中的形成。

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2.8 BVDV感染HSP90B1 KO细胞后病毒滴度检测

为验证HSP90B1对BVDV子代病毒形成的影响，BVDV TC株感染HSP90B1 KO细胞和对照Scramble细胞后，分别于12、24、36、48 h收集病毒液，利用Reed-Muench法测定不同病毒液中的病毒滴度，结果在BVDV感染HSP90B1 KO细胞12 h后与对照组相比，病毒滴度显著降低(P<0.05)，感染36 h后病毒滴度极显著性降低(P<0.01)(图10)，表明敲除HSP90B1能够抑制BVDV子代病毒的形成。

图10 BVDV感染HSP90B1 KO后病毒滴度检测

2.9 BVDV感染HSP90B1 KO细胞CPE情况

为验证HSP90B1对BVDV致细胞病变能力的影响，使用BVDV TC感染HSP90B1 KO细胞和对照Scramble细胞后，于不同时间利用倒置显微镜观察细胞病变效应，结果BVDV感染对照组Scramble细胞12和24 h后出现明显CPE，而HSP90B1 KO细胞很难观察到CPE，感染36和48 h HSP90B1 KO细胞出现明显CPE，但对照组Scramble细胞已出现大量CPE并有细胞脱落(图11)，结果表明敲除HSP90B1能够降低BVDV的致细胞病变能力。

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3 讨 论

牛病毒性腹泻病毒是一类无细胞结构、个体极小的微生物[18]，由于病毒缺少细胞结构特征，导致其必须依赖于宿主细胞进行复制和增殖，病毒从进入细胞，到细胞内的组装、复制、合成等都需要细胞内基因的辅助[19]。HSP90B1是一种热休克蛋白，主要参与ERS和细胞凋亡过程，Sengupta等[20]发现HSP90B1在日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染的小鼠大脑和Neuro2a细胞中显示出差异性，并强调了其在黄病毒感染期间对ER膜重塑和ERS的重要性[12]；Zhong等[21]通过STRING分析，发现HSPA5、HSPA1B、HSP90B1和HSPA6四种热休克蛋白可能与MDBK细胞中山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3)的增殖有关；本研究组前期使用BVDV TC感染MDBK细胞后进行蛋白质谱筛选差异基因，结果显示HSP90B1具有显著性差异(未发表)。为验证蛋白质谱的结果，本研究使用qRT-PCR检测BVDV感染MDBK细胞后HSP90B1 mRNA的转录水平，结果感染24 h时HSP90B1 mRNA转录水平显著升高(P<0.05)，36和48 h时极显著升高(P<0.01)，利用Western blot检测BVDV感染MDBK细胞后HSP90B1蛋白表达水平，显示感染后HSP90B1蛋白的表达量明显升高；表明BVDV感染能够诱导MDBK细胞中HSP90B1的表达，猜测HSP90B1基因可能会影响BVDV的复制。

为研究基因对病毒的影响，Liang等[22]敲低三基序蛋白26(tripartite motif containing 26，TRIM26)发现，TRIM26参与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的复制，并且减少TRIM26的表达能够降低HCV RNA和NS3蛋白表达水平；Mladinich等[23]利用CRISPR/Cas9技术发现C-C基序趋化因子配体5(C-C motif chemokine ligand 5，CCL5)是寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)持久性需要的重要因素；Isken等[24]敲除DNAJC14研究了该基因对于瘟病毒RNA复制的影响。为研究HSP90B1基因对BVDV复制的影响，作者应用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除MDBK细胞的HSP90B1基因，利用Western blot技术检测敲除效率，结果显示HSP90B1 KO细胞中的HSP90B1蛋白表达极明显降低，表明HSP90B1基因被敲除，成功构建HSP90B1 KO细胞，为后期研究HSP90B1对BVDV的复制提供细胞基础。分不同时间段进行细胞计数，结果显示相同时间生长内的细胞数量未见明显差异，表明敲除HSP90B1基因对细胞生长没有影响。

利用BVDV TC感染HSP90B1 KO和对照组Scramble细胞后，进行病毒含量检测。宋爽等[25]依据高度保守的BVDV 5′UTR基因，进行特异性引物设计，用荧光定量PCR检测BVDV，显示该方法具有灵敏度高、特异性好等优点，通过qRT-PCR检测BVDV 5′UTR RNA水平，结果与对照组相比，病毒感染HSP90B1 KO细胞12和24 h后BVDV 5′UTR RNA水平显著降低(P<0.05)，36和48 h后极显著降低(P<0.01)；间接免疫荧光法在临床中能够高效快速地检测BVDV分子，并且具有较高的特异性和可靠性，利用免疫荧光染色后BVDV dsRNA呈现绿色荧光，细胞核显示红色荧光与对照组相比HSP90B1 KO细胞中的绿色荧光明显减少；病毒滴度及CPE也是显示病毒表达量的方法之一，利用病毒滴度及CPE检测感染HSP90B1 KO细胞后的病毒含量，与对照组相比感染HSP90B1 KO细胞的病毒滴度在12 h后显著降低(P<0.05)，36 h后极显著降低(P<0.01)，CPE结果显示在感染12 h后对照组Scramble细胞出现明显CPE，而HSP90B1 KO细胞很难观察到CPE，感染36 h后HSP90B1 KO细胞出现CPE，但此时对照组Scramble细胞已出现大量CPE并有细胞脱落；以上结果显示HSP90B1 KO细胞中的病毒含量明显少于对照组Scramble细胞，表明敲除HSP90B1基因能够抑制BVDV的复制。

HSP90B1主要富集于ERS和细胞凋亡通路，有研究显示BVDV感染能够诱导ERS信号通路的激活[26]，而且抑制内质网葡糖苷酶的活性，能够阻止BVDV E2蛋白在高尔基体内的加工，并且降低病毒粒子的感染性[27]，以此推测HSP90B1基因可能通过调控内质网应激通路影响BVDV的复制，具体机制还需进一步研究。

4 结 论

BVDV感染MDBK细胞能够诱导HSP90B1表达；CRISPR/Cas9成功敲除MDBK细胞的HSP90B1基因，构建HSP90B1 KO细胞，敲除HSP90B1能够抑制BVDV的复制。