河蟹在三种清塘剂下的生长、耐缺氧能力和趋避行为

郭晏汝，丁丽花，葛家春，张曹旸，刘茂松

（1.南京大学生命科学学院，江苏 南京 210023；2.中国城市规划设计研究院，山东，青岛 266071；3.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017；4.江苏省常州高级中学，江苏 常州 213003）

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis H.Milne-Edwards 又称河蟹）是一种常见的经济蟹类。河蟹在海水中繁殖，淡水里生长，喜欢栖息于水质清新、水草丰富的淡水湖泊中，营穴居生活。在河蟹池塘养殖过程中,要注意病害防治，在蟹苗和幼蟹阶段，有单缩虫和聚缩虫附生，附生严重时，会影响幼体的正常活动和摄食；在幼蟹和成蟹阶段,有蟹奴虫和红丝虫寄生，蟹奴虫寄生严重时肉味恶臭，不可食用[1]。河蟹一旦得病很难医治，故以预防为主,放养前要清塘消毒[2]。

目前，我国河蟹养殖常用的清塘剂有三大类型：农药类主要有菊酯类和有机磷类；化学类主要有生石灰、漂白粉和氨水；植物类主要有茶粨巴豆和鱼藤。这些清塘剂均能达到杀死水中鱼虾类、螺蛳、水蚯蚓等水生生物的目的[3，4]。

清塘剂具有使用便利、成本低的优点。一些河蟹养殖户大量使用菊酯类农药清塘。姜礼燔等[5]试验证明：鱼类在清塘净浓度为0.05 mg/L 条件下24 h 内死亡；张婷等[6]研究表明：甲氰菊酯影响鲤（Cyprinus carpio）Na+-K+-ATP 酶活性以及损伤组织，表明清塘剂影响水生生物生长。为探究清塘威、清塘净及甲氰菊酯三种清塘剂对河蟹生长的影响，本试验通过室内模拟野外养殖，依据河蟹养殖技术流程中清塘剂的常规使用剂量、时效及河蟹生长的规律，进行生长成活统计、耐缺氧测定、趋避行为观察，以期为生产中清塘剂的使用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

中华绒螯蟹幼蟹体质量为（10±2）g，由江苏省淡水水产研究所扬中河蟹养殖基地提供。清塘威（主要成分：30%茶皂素+0.5%烟碱+增效剂）；清塘净（主要成分：氰戊菊酯20 g/mL）；甲氰菊酯（主要成分：20%甲氰菊酯）。饵料（配方见表1），由江苏省淡水水产研究所提供。饲养盒规格为φ=15 cm，h=24 cm，并添加（510±1）g 池塘底泥。

1.2 方法

添加清塘威为A 组、清塘净为B 组、甲氰菊酯为C 组，无清塘剂的对照组为D 组，每组设12 个重复。

1.2.1 生长观察试验

按清塘剂说明书的常规使用量，分别添加各自组别的1.5 mL 清塘剂加水稀释至1 500 mL。然后倾入有底泥的饲养盒中浸泡1 周，倾去残液，再在每个饲养盒中加入1 500 mL 曝气自来水（模拟清塘消毒）。饲养盒置于22℃～25℃实验室内，每盒投放1只蟹种，每组12 个饲养盒，观察、记录幼蟹的初始反应。每天根据河蟹实际摄食量投喂饲料，每周换水一次并观察河蟹的生长情况，50 d 后统计存活数（N）及最终体质量（WT）。

1.2.2 窒息试验

在野外三种清塘剂环境下，即清塘剂（按照各组清塘剂0.1 mL/m2）清塘后的河蟹养殖池塘，定期补水以使水位保持为1.0～1.5 m，饲养50 d 后的河蟹各12 个分别于置于500 mL 广口瓶中，加水并上覆2 cm 液体石蜡油封闭瓶口。当河蟹僵硬不动，轻弹瓶壁乃至摇动瓶体仍无反应时，即确认死亡，记录个体死亡所经历时间，此值为该河蟹的缺氧耐受时长，取水样测定其溶解氧含量值，即为该河蟹的窒息临界点。

1.2.3 趋避试验观察

依据早期试验观察，推测河蟹可能回避清塘剂，为定量描述与分析，设计了趋避试验。以“一”字型水迷宫为水环境选择的试验装置如图1，探究河蟹对不同清塘剂底泥的趋避性行为学。

图1 趋避实验示意图Fig.1 Schematic diagram of avoidance experiment

将A、B、C 组的三种清塘剂100 g 底泥放置于水迷宫（长100 cm、宽10 cm）的两端选择区的一端，另一端为D 组100 g 底泥，清塘剂处理的底泥分为早期（试验初期新配）和后期（50 d 饲养后）的底泥，每组取自无清塘剂的池塘河蟹30 只，以A 组为例，让河蟹在水迷宫中作出前期A-D、后期A-D 的选择，B、C 同理。观察15 min，记录试验蟹的首次选择结果及犹豫期时长（t），进行显著性检验。

1.3 数据处理

1.3.1 各组河蟹的生长

各组河蟹增重与相对增重率采用以下公式计算：

其中，Wt为河蟹最终体质量；Wo为河蟹初始体质量。

1.3.2 趋避行为试验参数计算

统计每组内试验蟹首次选择及其犹豫时间（t），即从试验开始到做出选择之间的时长，据此计算选择动机强度值（motivation intensity,MI）。

其中，T 为总观察时间；t 为犹豫时间，其单位均为秒（s）。

如果15 min 内，试验蟹没有做出任何选择（在静置区不动或逃逸），则记为未选择，定义为冻结行为者（freezing behavior individual）（以下简称“冻结者”，其MI=0）。

1.3.3 数据分析

试验结果以平均值±标准差（Mean±SD）表示。利用SPSS26.0 统计分析，对底泥趋避行为首次选择、各组河蟹成活率以及成活河蟹雌占比采用卡方检验（Chi-square test）进行检验，对动机强度指标MI 值使用T 检验，对河蟹绝对增重与相对增重率、窒息试验相关指标、趋避行为冻结者数采用单因子方差分析（one-way ANOVA）后，用Duncan 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 各组河蟹的行为表现

试验初始，A 组（清塘威）和D 组的大部分河蟹大约1～2 d 的较短时间钻进泥土中，而B 组（清塘净）和C 组（甲氰菊酯）中的河蟹则身体贴靠在饲养盒的边缘，大约一周后大部分才钻进泥土中。

2.2 存活与生长统计值分析

2.2.1 河蟹成活指标

试验期间，个别河蟹自行堆砌底泥逃逸，最终A 组和D 组为12 个重复，B 组和C 组为9 个重复。河蟹成活个数、初始与最终雌雄个数、成活率以及最终成活雌河蟹占比统计见表2。卡方检验结果表明：组间河蟹成活率差异不显著，最终成活河蟹雌性占比均无显著差异，表明清塘剂对河蟹的存活无显著性影响，对雌雄个体毒性也没有区别。

表2 河蟹成活个数、雌雄个数、成活率以及成活雌蟹占比统计表Tab.2 Statistics of number of survive,number of males and females,survival rate and female proportion of live crab

2.2.2 体质量增长数据

各组河蟹体质量、相对增重率增长数据见表3。由表3 可知：A 组河蟹增重量变异系数最高，说明A组的河蟹增重量不稳定，个体的增长差异较大。而B组和C 组河蟹增重量变异系数相对较小，说明这2组河蟹增重稳定，个体间增重差异较小。检验结果发现，三个试验组与空白对照组河蟹体质量绝对增长和相对增长率的差异显著，而各试验组间两项生长指标的差异不显著。

2.3 窒息试验

窒息试验相关指标包括以下8 项（表4）：首个个体死亡时的溶氧值FDDO（First death dissolved oxygen）及所经历时间DFD（Duration of the first death）；试验半数个体死亡时的溶氧含量值即半致死溶氧值SDO（Semi-lethal dissolved oxygen）及所经历的时间半致死耐受时长DST（Duration of semi-lethal tolerance）；末尾个体死亡时的溶氧值EDDO（dissolved oxygen level at end death）与所经历时间DED（Duration of the end death）；从第一个死亡至最后一个死亡的缺氧耐受时长和窒息临界点的平均值为该组整体缺氧耐受时长DHT（Duration of hypoxia tolerance）和整体窒息临界点SCP（Suffocation critical point）。三个试验组的窒息溶氧值与所经历时间与空白对照D 组差异显著（P＞0.05）。清塘剂组间相比，A 组半数个体死亡时溶氧值显著低于B和C 组，全部致死所经历时间显著高于B、C 组（表4）。

表4 窒息试验相关指标统计表Tab.4 Statistics of related indicators of suffocation experiment

2.4 对底泥的趋避行为

每组试验蟹中选择清水对照土壤端和清塘剂浸泡后的前期与后期土壤端的个体数，以及冻结者个数组间差异显著性检验结果见表5。河蟹对早期的A、B、C 组清塘剂底泥具有显著回避性，对后期的A 组清塘剂底泥的回避性不显著，但对后期的B、C底泥依然显著回避。

表5 首次选择显著性检验及冻结者个体数Tab.5 Significance test of individuals selected for the first time and the number of freezing behavior individuals

各组后期的试验蟹冻结者个数均显著大于前期，即后期出现了更多的犹豫行为（ambivalent behavior）的个体。动机强度MI 检验结果也与以上结果相符合（表6）。后期B、C 组对清水底泥的趋性动机强度大于清塘剂底泥。

表6 动机强度MI 值Tab.6 MI values of motivation intensity

3 讨论

3.1 清塘剂对河蟹趋避行为的影响

试验初始，河蟹接触陌生环境时具很强的防御性，入饲养盒中立刻钻进泥土中寻找安全位置。A组和D 组的河蟹一投放马上钻进泥土中，而B 组和C 组的河蟹贴着饲养盒，不立即钻进泥土中，可能是因为河蟹对茶皂素不敏感而对菊酯类药物很敏感。这与张小俊等[7]通过渔药毒性试验得出菊酯类药物溴氰菊酯对河蟹的毒性为剧毒的结论相符。当土壤中有残留的菊酯类药物时，河蟹会排斥，所以贴着饲养盒壁而不立即钻进泥土中。据此现象设置了趋避试验加以验证。已有研究报道，甲壳动物通过化学感受器获得其生存环境的信息，表现出摄食、逃避捕食者等行为反应[8]。趋避试验结果表明，后期的A 组底泥与空白对照组底泥对河蟹产生相同的化学刺激效果；其他试验组的底泥较对照组而言仍为消极信号，即各清塘剂毒性随时间下降，其中清塘威毒性下降最明显。

3.2 清塘剂对河蟹成活的影响

在检测河蟹成活率以及最终成活雌性占比差异显著性时得到的结果是：三个试验组和空白对照组无显著差异。这是由于试验数据为小样本数据，但可以看出三种清塘剂对河蟹的成活率均低于空白对照组，说明清塘剂对河蟹成活有一定影响。罗毅志等[9]研究表明：在茶皂素浓度为25 mg/L 时，麦穗鱼（Pseudorasbora parva）、鲫（Carassius auratus）等鱼类死亡；陶滕州等[10]试验表明，氰戊菊酯对仿刺参（Apostichopus japonicus）幼参为高毒物质；尹伊伟等表明甲氰菊酯对于鱼类毒性较高且对鱼类鳃组织造成病理学损伤[11]，表明清塘剂影响水生生物成活，与上述结论一致。

3.3 清塘剂对河蟹生长的影响

添加茶皂素和烟碱的A 组河蟹的体质量变异系数较高，说明清塘威响体质量增长上差异显著，而添加菊酯类清塘剂组河蟹的体质量增长变异系数较低，说明菊酯类清塘剂对河蟹体质量增长抑制作用有普遍性。0.005 μg·L-1溴氰菊酯处理14 d 产生不可逆组织病理损伤[7]，可进一步解释抑制体质量增长的原因。

清塘威清塘的原理是烟碱起主要作用，茶皂素起增效剂作用，是通过选择性控制昆虫神经系统烟碱型乙酰胆碱酯酶受体，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，使之由兴奋、痉挛到麻痹而死亡[13,14]。其作用过程中会使部分个体提高抗逆性，产生具有抵抗力的个体，这可能是A 组河蟹的体质量变异系数相对较高的原因。

甲氰菊酯在水中溶解度较小，难以挥发，受土壤的吸附性极强，主要吸附在土壤表层，降解缓慢，后期降解的速度取决于土壤中可降解菊酯类微生物的含量和氧气含量。微生物含量越多，菊酯降解速度越快；氧气越充足，降解速度越快[15]。本试验中使用的土壤主要为粘性土壤，氧气含量少，减缓了甲氰菊酯降解的速度，使甲氰菊酯残留在土壤中，长期使用，残留蓄积抑制了河蟹的生长[16,17]。

3.4 清塘剂对窒息相关指标的影响

以往对河蟹的窒息研究主要关注窒息点与耗氧量。周立红等[19]试验得出了不同大小及发育阶段的河蟹幼体耗氧、窒息临界溶氧点以及半致死溶氧点。本试验测定各类窒息点所经历的时间，以时间为评估耐缺氧的主要指标，在另一种尺度上衡量河蟹的耐缺氧体能。有些物种的甲壳类研究已经得出社群状态对河蟹可能存在着社会促进（social facilitation）或者社会抑制（social inhibition）影响的结论[20]。本试验在单养河蟹条件下进行，以消除社群互动对试验结果的误差。清塘剂显著抑制河蟹耐缺氧体能，清塘剂试验组之间相比，A 组半数个体死亡时溶氧值显著低于B、C 组，全部致死所经历时间显著高于B、C 组，这与趋避行为试验结果相符合，表明清塘净、甲氰菊酯对河蟹的毒性大于清塘威。

3.5 结论

研究结果表明，清塘剂对河蟹种群具有普遍而明显的抑制生长作用。生产中，清塘威对河蟹种群生长抑制作用较小，静置后毒性下降更明显，更适合应用。而耐缺氧试验表明，清塘剂显著抑制河蟹耐缺氧体能力，说明清塘剂的使用不可避免对河蟹种群生长造成不利影响。综上所述，出于环保与健康化养殖的角度，建议慎用农药类清塘剂。本试验探究了清塘威、清塘净、甲氰菊酯三种清塘剂对河蟹种群各项指标的影响，但这三种清塘剂对河蟹的安全剂量和有效剂量的平衡参数仍需进一步探究。