不同螯合剂诱导下黑麦草对铅污染土壤的修复效果研究

刘宝勇，陶晓楠，杨奇丽，郑晶伦，赵志浩

(辽宁工程技术大学环境科学与工程学院，辽宁阜新 123000)

近年来，由于工业排放、汽车尾气、农药使用等人为活动影响，我国土壤面临的重金属污染问题日趋加重，Li等[1]对我国沈阳市铁西工业区土壤的重金属污染现状进行了研究，其中调查土壤中Pb2+污染超标的占比1.5%，位居第二，农产品的质量安全受到严重影响[2-4]。重金属污染土壤的修复模式主要包括固化/稳定化、植物修复、微生物修复、化学淋洗、电动修复等[5-7]，其中植物修复重金属污染土壤技术具有操作简便、成本低廉、效果持久等优势，近年来成为污染土壤修复领域的研究热点[8-9]。植物修复技术是利用植物对土壤内重金属的良好吸收和富集作用，将土壤中的重金属逐渐转移到植物体内，再通过收获植物从而减少土壤中重金属浓度[10]。目前，世界上发现的超富集植物有400多种[11-13]。螯合诱导技术是最具发展潜力的植物修复强化措施之一[14-15]，通过活化土壤中的重金属离子，与重金属离子形成螯合物从而促进植物对重金属的吸收和由根部向地上部转运的能力，进一步达到提高生物有效性、降低重金属植物毒性以及提高重金属积累量和提取效率的目的，在铅污染处理中得到广泛应用[16-18]。相关研究表明，乙二胺四乙酸(EDTA)和氨三乙酸(NTA)2种螯合剂在不同施用方式下对不同植物修复铅污染土壤具有强化效应[19]，EDTA可以提高土壤水溶性铅的浓度，促进铅从根部向地上部转运，增加植物地上部铅的浓度和提取量[20]。黑麦草是一种重要的牧草和绿化植物，具有适应范围广、生长快速、易于收割的特点，十分适合用作重金属修复植物。该研究选用黑麦草为修复植物，通过盆栽试验，探究乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化铁(FeCl3)和柠檬酸(CA)3种常见重金属螯合剂对黑麦草生长规律和修复铅污染土的强化效果的影响，比较3类螯合剂作用下黑麦草对不同浓度铅污染土壤中重金属的富集作用和转运效果，明确3类螯合剂对强化黑麦草修复铅污染土壤的可行性，以期为铅污染土壤植物修复工程提供重要的理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料该试验所用土壤均取自辽宁省阜新市辽宁工程技术大学校园，土层深度为10～20 cm的表层土，取样时间为2020年4—6月。将土壤取回实验室后烘干破碎，再过2 mm筛，测试土壤的基本理化性质，发现土壤含水率为22.5%、有机质浓度为1.8%,pH为6.85，主要由粉粒组成，占比为54.3%。向土壤中分别加入质量比为2‰尿素、3‰复合肥粉末和1%生物底肥，搅拌均匀后备用。黑麦草种购买于山东立国农业发展有限公司。供试螯合剂选用乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)、氯化铁(FeCl3)和柠檬酸(CA)，选用醋酸铅[Pb(CH3COOH)2·3H2O]配制铅污染土壤，上述药品均购自上海麦克林生化科技有限公司；所有试剂均为分析纯。

1.2 试验方法试验所用土壤为人工污染土，土壤的Pb2+浓度分别为0、200、500、1 000和2 000 mg/kg，以硝酸铅水溶液的形式分层加至土壤中，同时控制土壤含水率为田间持水率的70%，密封2 d后将土壤搅拌均匀，再次密封平衡28 d，确保土颗粒-水分子-铅离子能均匀充分结合。取1.8 kg处理土壤装入盆内，盆的内径和高度均为15 cm。先将黑麦草种用浓度5%的次氯酸钠溶液冲洗一遍，随后放入蒸馏水中浸泡30 min，再将草种直接播入装有土壤的盆内，每个处理做4个重复，共计20盆土壤。控制每盆草种的播入量为20颗。将播有草种的处理盆直接放在室内养护，温度为20～28 ℃，相对湿度50%～70%，确保自然光充足。养护期间每7 d 喷洒蒸馏水250 mL，确保土壤含水率控制在田间持水率的60%～80%。黑麦草种在播下5 d左右开始发芽生长，生长14 d后，将每盆黑麦草苗均保留到5株，确保每盆留存的苗体生长健康且高度基本一致。生长21 d后，将浓度为10 mmol/L 的EDTA、FeCl3和CA溶液分别喷洒至对应试验组的幼苗上，每7 d喷洒一次，每次每盆喷洒50 mL，连续喷洒3次后处理完成，未喷洒任何螯合剂的盆栽作为对照组(CK)。继续生长18 d后，对盆内黑麦草进行收割测试。

1.3 测定分析将收割的黑麦草苗按照茎叶(地上部分)和根系(地下部分)分开处理，先将茎叶和根系用蒸馏水清洗干净并自然晾干，随后放入烘箱在105 ℃条件下杀青30 min，再在75 ℃条件下烘干至恒重。采用分析天平分别测试黑麦草根系与茎叶的干重量(生物量)，然后再将植物体人工磨碎并过0.15 mm筛备用。

采用原子吸收分光光度计对黑麦草根部和茎叶内的铅浓度进行测试分析。取1.00 g植物体粉末放入坩埚内，然后置于马弗炉内在500 ℃下灼烧6 h，冷却后取出，确保植物体完全灰化。向灰化后的植物体内加入10 mL HNO3∶HClO4=9∶4(v/v)的浓酸消解24 h[21]，再采用火焰原子吸收分光光度计对浸出液内Pb2+浓度进行测试，从而得到植物体内的Pb2+浓度。

1.4 数据处理与分析根据测试结果，分析黑麦草生长过程中的铅污染富集效果，分别计算黑麦草耐性指数(TI)、生物富集系数(BCF)和Pb2+转运系数(TF)，计算方法如下[22]：

(1)

(2)

(3)

该试验图形处理利用Origin 2021软件完成，统计分析采用SPSS 20.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 不同螯合剂作用下黑麦草对Pb2+的耐性分析从不同土壤Pb2+浓度作用下黑麦草的生长特性(图1)可以看出，随着土壤Pb2+浓度的增大，除FeCl3处理组外，各处理组黑麦草茎叶和根系生物量均出现先升高后降低的变化趋势，峰值均出现在土壤Pb2+浓度为500 mg/kg时。FeCl3处理组黑麦草茎叶和根系生物量随土壤Pb2+浓度的增大分别表现出先升高后稳定和先升高后降低的变化趋势，二者峰值均出现在土壤Pb2+浓度为1 000 mg/kg时。

与对照组(CK)相比，不同土壤Pb2+浓度下3种螯合剂对黑麦草茎叶和根系生物量的影响不同。EDTA处理组黑麦草茎叶和根系生物量在土壤Pb2+浓度为200 mg/kg时显著低于CK，其他土壤Pb2+浓度下无显著差异。FeCl3处理组黑麦草茎叶和根系生物量在土壤Pb2+浓度为200、500 mg/kg 时显著低于CK，在土壤Pb2+浓度为1 000、2 000 mg/kg时显著高于CK；当土壤Pb2+浓度为0 mg/kg时，FeCl3处理组黑麦草茎叶生物量与CK无显著差异，根系生物量显著低于CK。CA处理组黑麦草茎叶和根系生物量在土壤Pb2+浓度为0 mg/kg 时与CK无显著差异，在土壤Pb2+浓度为200、500、1 000 mg/kg 时显著低于CK，在土壤Pb2+浓度为2 000 mg/kg 时显著高于CK。整体上看，低浓度Pb2+(200 mg/kg)条件下，3种螯合剂对黑麦草茎叶生长均出现明显的抑制效果，随着Pb2+浓度增大，螯合剂对黑麦草的根系和茎叶生长的抑制出现改善。当土壤Pb2+浓度为2 000 mg/kg时，FeCl3处理组对黑麦草生长促进作用最为显著，黑麦草生物总量提高了约1倍。

注：不同小写字母表示同一螯合剂不同浓度间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一浓度不同螯合剂间差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different concentrations of the same chelators (P<0.05),different uppercase letters indicate significant difference between different chelators of the same concentration (P<0.05).图1 不同土壤Pb2+浓度下黑麦草茎叶与根系的生长状况Fig.1 Growth of ryegrass stems and leaves and root system under different soil Pb2+ concentration

植物耐性指数对于污染场地修复效果具有重要的影响，根据公式(1)可计算不同Pb2+浓度下黑麦草的耐性指数，结果如图2所示。当土壤受Pb2+污染程度不高时(浓度为200、500 mg/kg)，3种螯合剂作用下黑麦草的根系和茎叶耐性指数均小于1，表明植物生长受到抑制，其中FeCl3和CA对黑麦草生长的抑制效果较明显。当土壤受Pb2+污染程度较高时(浓度1 000、2 000 mg/kg)，FeCl3和EDTA这2种螯合剂对黑麦草的茎叶和根系生长均具有显著的促进作用。CA只有在土壤Pb2+浓度达到2 000 mg/kg时才对黑麦草生长表现出促进作用。

注：不同小写字母表示同一螯合剂不同浓度间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一浓度不同螯合剂间差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different concentrations of the same chelators (P<0.05),different uppercase letters indicate significant difference between different chelators of the same concentration (P<0.05).图2 不同土壤Pb2+浓度下黑麦草茎叶与根系的耐性指数Fig.2 Tolerance index of ryegrass stem,leaf and root under different soil Pb2+ concentrations

2.2 不同螯合剂作用下黑麦草对Pb2+的富集作用分析从黑麦草不同部位对Pb2+的富集作用(图3)可以看出，随着土壤Pb2+浓度的增大，黑麦草根系和茎叶Pb2+浓度均显著增加。不同土壤Pb2+浓度下，3种螯合剂对黑麦草茎叶和根系Pb2+浓度的影响有所差异。EDTA处理组和FeCl3处理组黑麦草茎叶和根系Pb2+浓度在土壤Pb2+浓度为0、200 mg/kg时高于CK，在其他土壤Pb2+浓度下显著高于CK。CA处理组黑麦草茎叶Pb2+浓度在所有土壤Pb2+浓度下均高于CK。CA处理组黑麦草根系Pb2+浓度在土壤Pb2+浓度为500 mg/kg 时显著高于CK，其他土壤Pb2+浓度下无显著差异。整体而言，当土壤中Pb2+浓度高于1 000 mg/kg时，FeCl3和EDTA对提升黑麦草富集Pb2+效果更为显著。对于Pb2+浓度为2 000 mg/kg土壤，施加FeCl3螯合剂后，黑麦草茎叶和根系对Pb2+的富集量分别为492.4和827.6 mg/kg，相比于CK对照组分别提高了2.64和0.95倍。

注：不同小写字母表示同一螯合剂不同浓度间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一浓度不同螯合剂间差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different concentrations of the same chelators (P<0.05),different uppercase letters indicate significant difference between different chelators of the same concentration (P<0.05).图3 不同土壤Pb2+浓度下黑麦草茎叶与根系对Pb2+的富集作用Fig.3 Enrichment of Pb2+ by stems,leaves and roots of ryegrass in different soil Pb2+ concentrations

注：不同小写字母表示同一螯合剂不同浓度间差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示同一浓度不同螯合剂间差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters indicate significant difference between different concentrations of the same chelators (P<0.05),different uppercase letters indicate significant difference between different chelators of the same concentration (P<0.05).图4 不同土壤Pb2+浓度下黑麦草茎叶与根系Pb2+的生物富集系数Fig.4 Bioconcentration coefficients of Pb2+ in ryegrass stems and leaves and roots under different soil Pb2+ concentrations

根据公式(2)计算不同土壤Pb2+浓度下黑麦草茎叶和根系Pb2+的生物富集系数，结果如图4所示。不同土壤Pb2+浓度下，黑麦草茎叶的生物富集系数(0.10～0.33)明显小于根系Pb2+生物富集系数(0.22～0.63)。随着土壤Pb2+浓度增大，对照组和CA处理组黑麦草的根系和茎叶Pb2+生物富集系数均持续降低，EDTA处理组黑麦草茎叶和根系Pb2+生物富集系数分别呈现出先降后升和持续下降的变化趋势，FeCl3处理组黑麦草茎叶和根系对Pb2+生物富集系数分别呈现出先降后稳定和先降后升的变化趋势。当土壤Pb2+浓度为2 000 mg/kg，EDTA处理组黑麦草茎叶和根系Pb2+生物富集系数显著大于CK，FeCl3处理组黑麦草茎叶和根系Pb2+生物富集系数显著大于CK，CA处理组黑麦草茎叶Pb2+生物富集系数显著大于CK，此时，EDTA对黑麦草茎叶Pb2+生物富集系数和FeCl3对黑麦草根系Pb2+生物富集系数相比于对照组分别提高了2.6和2.1倍。

2.3 不同螯合剂作用下黑麦草对Pb2+的转运效果分析单因素方差分析结果表明，不同Pb2+浓度下的黑麦草茎叶与根系的Pb2+浓度呈极显著差异(P<0.01)。不同Pb2+浓度下黑麦草根系与茎叶中Pb2+浓度的相关性如图5所示，不同Pb2+浓度条件下，对照组黑麦草的根系与茎叶中Pb2+浓度具有良好的线性关系，此时线性拟合曲线斜率(k1)为0.313。施加3种螯合剂后，不同Pb2+浓度土壤中黑麦草根系与茎叶的Pb2+浓度仍然具有良好的线性关系，此时拟合曲线斜率(k2)为0.567。表明随着3种螯合剂的加入，均可以促进Pb2+从植物根部向茎叶部位转移。

图5 不同Pb2+浓度下黑麦草茎叶与根系Pb2+浓度关系Fig.5 Relationship between Pb2+ concentration in ryegrass stem,leaf and roots under different Pb2+ concentrations

为进一步探究不同Pb2+浓度下黑麦草Pb2+的转运效率，根据公式(3)计算黑麦草Pb2+的转运系数，结果如图6所示。随着土壤Pb2+浓度增大，对照组黑麦草对Pb2+的转运系数逐渐减小，土壤Pb2+浓度为2 000 mg/kg时，对照组黑麦草的转运系数为0.32。3种螯合剂加入后，黑麦草Pb2+转运系数随着土壤Pb2+浓度增大出现先减小后增大的趋势，当土壤Pb2+浓度为500 mg/kg时，3种螯合剂作用下黑麦草的转运系数均出现最小值，当土壤Pb2+浓度达到2 000 mg/kg，EDTA、FeCl3和CA作用下黑麦草Pb2+的转运系数分别为0.56、0.59和0.48，相比于对照组分别提高了0.75、0.84和0.50倍，此时根系部位富集的Pb2+大部分可转运至茎叶部位以供收割。

图6 不同螯合剂诱导下黑麦草Pb2+的转运系数Fig.6 Transport coefficients of Pb2+ in ryegrass induced by different chelators

3 结论与讨论

研究表明，黑麦草对土壤Pb2+有良好的耐受性和富集作用，整体表现为中低浓度(≤500 mg/kg)促进生长，高浓度(≥1 000 mg/kg)抑制生长。3种螯合剂加入后，黑麦草对土壤Pb2+的耐受性和富集作用在一定程度上发生改变，具体表现为低浓度(<500 mg/kg)抑制生长，而中高浓度促进生长。当土壤Pb2+浓度为2 000 mg/kg时，FeCl3对黑麦草生长促进作用最为显著，对应黑麦草生物量提高约1倍。推测其原因可能与植物受到环境的影响有关。低浓度Pb2+作用能够提高植物叶绿体的酶活动，从而加速叶绿素的合成，促进植物生长。但当土壤内Pb2+过高时，会影响植物的呼吸作用和细胞器的正常结构，并抑制根细胞的光合作用和有丝分裂，从而抑制了植物生长[23]。

该研究中，黑麦草对Pb2+的富集作用规律表现为根系>茎叶，且根系与茎叶中Pb2+浓度表现出较好的线性相关关系。黑麦草具有富集重金属Pb2+的能力，Pb2+主要富集于其根部，施加不同类型螯合剂后可显著增强黑麦草对土壤重金属Pb2+污染的修复效率[24]。3种螯合剂加入均能显著促进黑麦草对Pb2+的富集作用，具体表现为低浓度(≤200 mg/kg)时CA>EDTA>FeCl3，中低浓度(500 mg/kg)时EDTA>CA>FeCl3，中高浓度(1 000 mg/kg)时EDTA>FeCl3>CA,高浓度(>1 000 mg/kg)时FeCl3>EDTA>CA，因此，对于受Pb2+污染程度较高的土壤，选用FeCl3诱导黑麦草的方式可对场地Pb2+浓度起到较好的降低作用。EDTA对黑麦草修复任何Pb2+浓度土壤具有较好的提升作用，而FeCl3仅对Pb2+污染程度严重的土壤修复才能起到较好的促进作用，CA对黑麦草修复Pb2+污染程度严重的土壤修复效果影响较小。对于Pb2+污染程度较高的土壤，EDTA和FeCl3诱导作用下可显著提高黑麦草对Pb2+的富集效率，有利于提升污染场地的植物修复效果。而CA诱导作用下对于黑麦草修复Pb2+污染程度较低的土壤提升效果明显。

该研究表明3种螯合剂的施加均能促进黑麦草对重金属Pb2+的富集作用，综合考虑螯合剂适应性及成本，EDTA和FeCl3这2种螯合剂对于黑麦草修复高浓度Pb2+污染土具有良好的提升效果，且FeCl3效果更为显著。