水稻Os01g0853700基因对植物激素和非生物胁迫的响应分析

刘娇妍 朱嘉慧 肖浩扬 麦淑桃 李琳 王丽敏 唐辉武

摘要：一个未知功能的水稻（Oryza sativa L.）MYB转录因子Os01g0853700被克隆，并对其进行系统进化分析和表达分析。结果表明，Os01g0853700与单子叶植物Os01g0853700同源蛋白具有更近的亲缘关系，与双子叶植物Os01g0853700同源蛋白具有相对较远的亲缘关系。组织表达分析结果表明，Os01g0853700在水稻根、茎、叶和幼穗中均有表达，在叶片中表达水平最高。激素处理响应表达分析结果表明，Os01g0853700对脱落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellicacid，GA）、生长素（indoleaceticacid，IAA）、多效唑（paclobutrazol，PAC）等激素处理的响应表达均达到显著差异水平。胁迫处理响应表达分析结果表明，Os01g0853700对低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、盐胁迫及干旱处理的响应表达均达到显著差异水平。由此推测，Os01g0853700可能参与水稻激素和逆境胁迫响应。本研究结果可为后续Os01g0853700转录因子的功能研究提供参考。

关键词：水稻；MYB转录因子；表达分析；植物激素；非生物胁迫

中图分类号：S511.01；Q786  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）23-0028-07

MYB轉录因子在植物中普遍存在，并且在植物的生长发育和代谢调控中起着重要的作用，如细胞形态建成、次级代谢调控以及生物和非生物胁迫的应答等。MYB转录因子的N端存在一类高度保守的结构域——R结构域，它是一种由约50个氨基酸组成的折叠蛋白，其中包含了一系列高度保守的氨基酸残基和间隔序列。在与DNA的结合过程中，氨基酸残基以螺旋-转角-螺旋（HTH）的形式参与其中。间隔序列在每隔18个氨基酸的位置上形成1个疏水核心，对HTH构型的维持至关重要［1-2］。MYB转录因子根据其所含的R结构域数量分为4个亚类。其一是含有单一R结构域的MYB蛋白，也称为1R-MYB/MYB-related，属于端粒结合蛋白，对于维持染色体稳定性具有重要作用［2］。其二是含有2个R结构域的MYB转录因子亚类，被称为R2R3-MYB蛋白。在植物中，这是最常见的一类蛋白，在细胞分化、激素应答、次生代谢等方面具有重要作用，此外还参与环境胁迫以及抵抗病虫侵害的响应［3］。其三是含有3个R结构域的MYB转录因子。研究表明，该转录因子与真菌中的3R-MYB蛋白存在较近的同源关系，同时调节细胞周期和细胞分化过程，参与植物对逆境的耐受性调节［4］。其四是含有4个R结构域的MYB转录因子，这些蛋白拥有4个与R1/R2结构相似的重复，因此被称为 4R-MYB 蛋白［5-6］。然而，这个亚类只在诸如拟南芥、葡萄和杨树等植物中发现了少数基因。目前对于这个结构的研究还很有限，其功能尚不十分清晰［7］。总之，MYB转录因子是一类具有不同R结构域数量的蛋白，它们在调控基因转录、细胞分化、激素应答、次生代谢以及逆境响应等方面发挥着重要作用。每个亚类的蛋白在功能和调节机制上都有所不同，但它们共同构成了一个复杂而多样化的调控网络。MYB转录因子参与植物的生长发育、代谢调控和调节植物对生物和非生物胁迫的应答［8-9］。目前对水稻MYB家族基因的功能有了一定的研究，MYB转录因子OsPHR1、OsPHR2和OsPHR3调控水稻根的生长，任何一个功能缺失均会减弱主根根毛生长，而过表达任何一个则会导致茎部磷（P）积累［10］。OsMYB36a、OsMYB36b和OsMYB36c协同调控水稻根内皮层木质素沉积、凯氏带的形成，并在根的养分选择性吸收中扮演着重要角色［11］。水稻MYB家族的CTMyb1能通过结合蛋白酶基因（Rep1）启动子的CARE元件，参与调控赤霉素诱导的Rep1的表达［12］。此外，MYB转录因子在叶绿素降解调控和盐胁迫响应方面也有重要作用，OsRL3在黑暗诱导衰老以及盐胁迫条件下显著表达。同时，OsRL3的表达受脱落酸的诱导，且突变体osrl3对外源ABA的敏感性低于野生型。说明MYB转录因子OsRL3可通过ABA信号途径调控叶片衰老和盐胁迫响应［13］。OsMYB30在水稻耐冷性方面有重要作用，敲除OsMYB30基因，突变体耐冷性增强；过表达OsMYB30基因，突变体耐冷性减弱［14］，同时还发现过表达OsMYB30增强了稻瘟病抗性，而敲减OsMYB30会降低稻瘟病抗性，表明OsMYB30正调控免疫反应［15］。OsMYB30还能激活木质素和肉桂酸合成，增强水稻的免疫反应，包括对真菌和细菌的抗性［16］。OsMYB22是茉莉酸信号通路的关键组成部分，能直接与几丁质结合蛋白基因OsCEBiP的启动子结合，并与OsMYC2互作，协同激活OsCEBiP的表达，参与调控水稻对稻瘟病菌的基础抗性［17］。

尽管水稻中已有若干MYB转录因子的功能被报道，但是该基因家族成员众多，还有很多基因的功能依然未知。本研究鉴定到一个新的编码MYB转录因子的基因Os01g0853700。通过生物信息学技术，分析该基因的理化性质和结构，构建系统进化树，并利用qRT-PCR技术检测不同条件下Os01g0853700的表达模式，旨在探讨Os01g0853700的蛋白结构及进化关系、Os01g0853700在正常条件以及激素和非生物胁迫条件下的表达模式，为进一步研究该基因的功能提供理论支持和研究方向。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

本试验以粳稻（Oryza sativa ssp. japonica）中花11（Zhonghua 11，ZH11）为供试材料。试验时间为2022年3—5月，试验地点为广东省广州市。

1.2 试验处理和取样

1.2.1 Os01g0853700的表达模式分析取样

水稻幼苗在自然条件下使用木村B营养液［18］进行培养，在水稻幼苗生长至3～4叶期时，收集水稻的根组织样品，用于Os01g0853700基因的组织表达分析。孕穗期分别取大田自然生长条件下的茎、叶和幼穗（2～3 cm）组织样品，用于Os01g0853700基因的组织表达分析。每个试验设置3次生物学重复。

1.2.2 植物激素处理、非生物胁迫处理及取样

1.2.2.1 植物激素处理

將在光照培养箱中（光照和黑暗时间均为12 h，光照时温度28 ℃，黑暗时温度25 ℃）培养至3～4叶期的水稻幼苗分别移至含有各种植物激素的木村B营养液中进行处理。PAC、GA、IAA和ABA等激素的处理浓度为 0.01 mmol/L，除营养液中加入相应的激素外，处理时其他培养条件与之前的培养条件均一致，分别于处理后 0、1、2、8、24 h收取水稻叶片。

1.2.2.2 非生物胁迫处理

将在光照培养箱中（光照和黑暗时间均为12 h，光照时温度28 ℃，黑暗时温度25 ℃）培养至3～4叶期的水稻幼苗分别转移到含有0.2 mol/L NaCl、20% PEG-6000的水培营养液中，并在42 ℃和4 ℃的光照培养箱中进行处理，处理0、1、2、8、24 h时进行取样。处理时其他培养条件与之前的培养条件均一致。

1.3 RNA提取和qRT-PCR扩增

1.3.1 总RNA的提取和cDNA第一链合成

利用TRIzol试剂将细胞或组织破碎，并与RNA结合形成复合物，然后通过乙醇沉淀将RNA分离出来，再根据南京诺唯赞生物科技公司的反转录试剂盒（Vazyme，R312-01）说明书的操作步骤，进行反转录合成cDNA的第1链。

1.3.2 qRT-PCR分析

根据Os01g0853700的CDS序列，设计qRT-PCR特异引物MYB-F/MYB-R（表1），以水稻Actin1作为内参基因。采用ABI PRISM 7500HT实时荧光定量PCR仪检测Os01g0853700的表达量，根据南京诺唯赞生物科技公司的qRT-PCR试剂盒（Vazyme，Q711-02）说明书配置反应体系。反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个样品均设置3个技术重复，采用2-ΔΔCT计算Os01g0853700的相对表达量。

1.4 生物信息学分析

利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库获取Os01g0853700的编码区和氨基酸序列。利用MEGA 7.0的ClustalW软件进行氨基酸序列多重比对，再使用近邻法构建系统进化树。同时，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线分析工具对Os01g0853700的启动子序列（起始密码子ATG上游2 000 bp的基因组序列）进行顺式作用元件分析。

2 结果与分析

2.1 Os01g0853700基因及蛋白结构分析

通过NCBI网站比对分析显示，Os01g0853700基因包含2个外显子、1个内含子，编码区全长900 bp，共编码299个氨基酸。Os01g0853700包含2个高度保守的SANT结构域（图1），属于含有2个R结构域的MYB转录因子亚类、R2R3-MYB蛋白。

2.2 Os01g0853700同源蛋白序列比对及进化分析

将Os01g0853700与其他植物的同源蛋白进行氨基酸序列比对，结果显示，Os01g0853700与其他同源蛋白在47～259位之间的氨基酸高度相似（图2）。构建的Os01g0853700及其同源蛋白的系统进化树表明，Os01g0853700与沼生菰（Zizania palustris）的同源蛋白聚为一支，与小麦（Triticum aestivum）、大麦（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、谷子（Setaria italica）和稷（Panicum miliaceum）的同源蛋白的亲缘关系相对较近；与毛地黄（Digitaria exilis）、黄桐（Endospermum chinense）、大麦草（Hordeum secalinum）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）的同源蛋白亲缘关系相对较远（图3）。

2.3 Os01g0853700基因启动子区域的顺式作用元件分析

将Os01g0853700起始密码子ATG上游 2 000 bp 的基因组序列设置为该基因的启动子序列，然后利用PlantCARE在线分析软件对Os01g0853700的启动子序列进行顺式作用元件分析。结果表明，Os01g0853700的启动子区域存在23个脱水响应元件、11个光响应元件、3个低温响应元件、1个水杨酸响应元件、3个热激响应元件、3个MYB转录因子结合的相关元件和1个脱落酸响应元件（表2）。

2.4 Os01g0853700的表达分析

2.4.1 Os01g0853700表达模式分析

为了分析Os01g0853700的表达模式，本研究提取了ZH11苗期的根以及孕穗期的茎、叶和幼穗的总RNA，并利用qRT-PCR进行检测。结果（图4）显示，Os01g0853700在水稻根、茎、叶和幼穗中均有表达，但在叶片中的表达水平相对较高。

2.4.2 外源激素处理对Os01g0853700的表达影响分析

为了研究Os01g0853700对激素的响应特征，本试验分别检测不同激素处理下水稻叶片中Os01g0853700的表达水平。结果表明，脱落酸（ABA）处理后，Os01g0853700的表达水平呈现持续下降的趋势；处理24 h时，Os01g0853700的表达水平达到最低（图5-A）。赤霉素（GA）处理2 h时，Os01g0853700的表达水平呈现最高状态，随后有所下降（图5-B）。生长素（IAA）处理后，Os01g0853700的表达水平呈现先上升后下降的趋势；处理2 h时，Os01g0853700的表达水平达到峰值（图5-C）。多效唑（PAC）处理后，Os01g0853700的表达量总体呈现上升的趋势；在处理24 h时表达水平相对最高（图5-D）。说明Os01g0853700受以上4种激素诱导表达。

2.4.3 逆境胁迫处理对Os01g0853700基因的表达影响分析

启动子顺式作用元件分析表明，Os01g0853700启动子区域存在多个与逆境胁迫响应相关的元件，推测Os01g0853700基因可能参与水稻逆境胁迫响应。因此，对水稻幼苗进行低温、干旱、盐害和高温胁迫处理，并检测Os01g0853700的表达变化。结果表明，低温处理后，水稻叶片中Os01g0853700的表达水平呈现先升后降再升的趋势，处理24 h时的表达水平达到最高（图6-A）。

PEG-6000处理24 h时，水稻叶片中Os01g0853700的表达量达到最大值（图6-B）。NaCl处理后，Os01g0853700的表达水平呈现先降后升再降的趋势，处理8 h时，Os01g0853700的表达量达到最高（图6-C）。高温处理后，Os01g0853700的表达量呈现先上升后下降再上升的趋势，在处理24 h时表达水平最高（图6-D）。说明Os01g0853700的表达受低温、高温、干旱和盐胁迫诱导。

3 结论与讨论

MYB蛋白在多种生物中呈现出多种多样的细胞功能［19-20］。本研究克隆了1个新的水稻MYB基因家族成员Os01g0853700，其编码的氨基酸序列包含2个MYB蛋白家族典型的结构域（图1），具有MYB蛋白家族成员的典型基序。系统进化分析表明，Os01g0853700转录因子与单子叶植物物种中MYB102同源蛋白具有更近的亲缘进化关系，与双子叶物种中MYB102同源蛋白具有相对较远的进化关系（图3），形成了有明显差异的亚类分枝，推测MYB102蛋白在物种进化过程中被选择。Os01g0853700[JP+1]启动子区域存在多个与水稻生长发育和逆境胁迫相关的顺式作用元件（表2），说明Os01g0853700可能参与水稻相关细胞活动的调控。

研究表明，植物的激素和非生物胁迫对MYB基因家族的调控起着重要作用［21］。以盐胁迫为例，研究发现，OsMYB2基因的表达在盐胁迫下上调，这表明OsMYB2转录因子对盐胁迫具有响应能力。此外，研究还发现高表达OsMYB2基因的水稻品种种子在ABA的诱导下表现出更高的萌发敏感性，这进一步说明ABA参与了水稻OsMYB2基因对盐胁迫的响应机制［22］。有研究表明，编码水稻MYB家族转录因子的基因OsMPS也受到盐胁迫和ABA的诱导，但其表达受到赤霉素和生长素的抑制［23］。本研究中的植物激素响应表达分析结果显示，在不同激素处理（ABA、GA3、IAA、PAC）下，叶片中Os01g0853700的表达量均与对照达到显著差异水平，这说明Os01g0853700可能參与多种激素调控响应（图5）。同时，Os01g0853700的表达受盐胁迫诱导（图6-C），说明Os01g0853700可能通过上述激素信号转导途径参与盐胁迫响应。MYB转录因子中OsMYB4、OsMYB3R-2、OsMYBS3参与水稻冷胁迫响应［24-26］。OsMYBR1、OsMYB6参与水稻干旱胁迫响应［27-28］。Os01g0853700的表达在低温、高温和干旱胁迫中出现显著变化，推测Os01g0853700可能参与水稻逆境胁迫响应（图6）。

MYB转录因子在各物种细胞活动中必不可少，本研究克隆了水稻MYB转录因子家族基因Os01g0853700，并了解其蛋白的演化关系、蛋白结构域和保守基序、基因启动子顺式作用元件等，鉴定了Os01g0853700的组织表达模式、激素和胁迫处理的响应表达模式，为后续通过其他方式验证Os01g0853700及其同源基因的功能提供了研究方向和科学依据。

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