外泌体在多发性骨髓瘤中的作用及其应用前景

李 姣,黄晓兵,2△

(1.电子科技大学,四川 成都 610041;2.四川省医学科学院·四川省人民医院血液内科,四川 成都 610072)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)作为发病率高居第二位的血液系统恶性肿瘤,截止2020年全球发病率约2.1/10万(约160000例)[1],是一种起病隐匿、至今仍无法治愈的血液系统疾病,其特点是骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)过度生成,导致典型的CRAB症状,即高钙血症、肾功能不全、贫血、骨病,而绝大多数MM患者会进展为严重的溶骨性骨病。MM发病的中位年龄为 69 岁,大约63% 的MM患者年龄超过 65 岁,随着科技的不断发展,治疗MM的新型药物不断更新,但是大多数MM患者仍面临成为难治性骨髓瘤或治疗后复发的困境,全世界每年约有10万人死于多发性骨髓瘤[2]。外泌体作为细胞间信号传递的重要媒介,在MM的背景下,保证了MM细胞和骨髓环境细胞之间不断的相互作用,目前已证明包含在外泌体中的各种成分,通过支持免疫抑制作用、血管生成、骨质溶解和耐药性来维持MM肿瘤发生发展,促进MM浆细胞的生长。现阶段MM的诊断及疗效评估主要以骨髓检查为主,对于高发病率、高死亡率的MM而言,骨髓检查无法突破采样异质性的缺陷,在这种情况下,外泌体能检测和监测髓外病变的优势得到彰显,监测不同阶段的外泌体可在一定程度上反映疾病过程,因而外泌体成为近来各大领域争相研究的热点。这篇综述主要关注外泌体在MM发生发展中作用的研究进展,以及其作为生物标志物及治疗靶点的应用价值。

1 外泌体简介

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)是细胞间进行信息传递的重要介质,因大小和分泌途径不同而分为外泌体、凋亡小体和微囊泡,而碍于提取技术的限制,国际细胞外囊泡学会(ISEV)基于细胞外囊泡研究的最小信息,建议使用小型细胞外囊泡和中大型细胞外囊泡代替外泌体和微囊泡,但根据惯例,许多实验室仍然习惯性继续使用“外泌体”一词,本文中提到的外泌体可互换为小型细胞外囊泡[3]。外泌体是多种正常细胞和恶性细胞分泌的大小30～200 nm的囊泡,其密度在1.13～1.19 g/ml,含有多种生物分子,如蛋白质、核酸和脂质,蛋白质在外泌体表面含量丰富,包括共刺激分子(如CD86)、抗原提呈蛋白(如MHC-I和MHC-II)、膜融合蛋白、细胞间粘附分子1、整合素、四酯酶蛋白、多泡体形成蛋白(如Alix和Tsg10)以及跨膜分子[4]。从生物活性的角度来看,最重要的核酸分子包括mRNA、tRNA、微小RNA(miRNA)和其他非编码RNA(如长链非编码RNA和环状RNA)。外泌体分泌是一种组成性现象,参与机体主要的生理和病理过程,决定了外泌体表面分子和内容物,所含生物分子因生理及病理条件、原始细胞类型、起源细胞的不同而有所差异,从而使外泌体具有特异性。由于外泌体具有来源细胞特异性,故其可反应来源细胞的信息,监测外泌体的变化可有助于评估疾病状态及所处疾病阶段。

细胞通过胞吐作用产生外泌体,其被靶细胞摄取,通过在膜上呈递分子或通过内化后释放其载物,在局部或远处的细胞间实现蛋白质、核酸和脂质的转移,进一步实现多种生物信号的传递。外泌体是细胞间信息传递的关键介质,癌细胞较正常细胞外泌体的释放率和含量明显增加[5]。若肿瘤细胞数量增多、长势良好,则肿瘤来源外泌体释放量将增多,反之亦然,那么监测外泌体量的变化可反应肿瘤细胞生长趋势和侵袭性,在一定程度上体现病情的变化。另外,肿瘤来源的外泌体能够支持肿瘤生长并破坏组织细胞间的体内平衡,细胞外囊泡在驱动转移前肿瘤生态位的形成中起重要作用,细胞外囊泡能够通过其物质转移刺激肿瘤进展,肿瘤来源外泌体还会影响肿瘤微环境中的周围细胞,导致非肿瘤细胞通过释放外泌体来促进肿瘤的发生和发展[6],例如慢性粒细胞性白血病细胞释放的外泌体可以刺激骨髓基质细胞产生支持白血病生长的细胞因子[7];急性髓系白血病细胞系和原代急性髓系白血病母细胞分泌的外泌体进入基质细胞并改变其功能以促进白血病生长[8]。因外泌体所涉及的细胞因子、信号途径、代谢通路等具有广泛性和多样性,故目前为止,其在肿瘤发生发展中所起的作用及具体机制仍未完全清楚,故针对外泌体的研究在肿瘤领域备受青睐。

2 外泌体在MM中的作用

包裹在外泌体中的各种成分可以促进 MM 浆细胞的生长:主要是非编码遗传物质,例如miRNA,可作为抑癌基因或致癌基因发挥作用,从而改变 BM 环境,改变细胞因子间平衡,可能有利于骨髓瘤细胞的生长。PIWI相互作用RNA(piRNA)是一种非编码单链RNA,对基因组表达具有至关重要的作用,RNA-004800 (piR-004800) 在源自 MM 受试者的 BM 上清液和培养的 MM 细胞的外泌体中均表达增强,piR-004800 的表达通过鞘氨醇-1-磷酸受体(S1PR)作用PI3K/Akt/mTOR通路调控,在MM细胞生长中起重要作用。除此之外,外泌体中包含的其他非编码遗传物质长链非编码RNA(long noncoding RNAs, lncRNAs),如LINC00461,在MM中大量产生,而间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)来源的外泌体通过控制LINC00461表达刺激MM细胞的生长。另一种不同类型的非编码遗传物质是广泛分布在人体组织中的内源性非编码RNA—环状RNA(cirRNA), 其过表达可促进MM细胞生长,如骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cell, BMSCs)释放的外泌体通过过表达circ_0007841,改变MM细胞的细胞周期,并减少了程序性细胞死亡而促进MM细胞的生长[9～12]。

血液肿瘤和骨髓环境之间的细胞间相互作用,是通过可溶性成分和细胞间连接完成的,外泌体作为作用于生物通讯和生物反应的细胞间可溶性成分,在MM疾病情况下,包含在外泌体中的各种成分保证了MM细胞和骨髓环境细胞之间不断的相互作用,并通过支持免疫抑制作用、血管生成、骨质溶解和耐药性来维持MM肿瘤发生发展,促进MM浆细胞的生长。

2.1 外泌体促进MM骨质溶解MM起病缓慢、早期无明显症状,以至于在MM诊断时大约60% 的患者已存在骨病, 骨病带来的疼痛、病理性骨折将严重影响患者生活质量和预后,骨病的发生主要为成骨和破骨失衡所致,而外泌体在打破这一平衡中起到举足轻重的作用。表皮生长因子受体(epidermal growth gactor receptor, EGFR)系统可以调节不同的生长和分化过程,IL8则是MM骨病中骨损伤的重要刺激物,存在于MM外泌体中的双调蛋白,能与破骨细胞前体和MSCs中的双调蛋白结合,从而激活破骨作用并阻止干细胞向成骨细胞分化,同时,源自MM富含双调蛋白的外泌体进入MSCs能增强MM细胞粘附和IL8的传递,参与富含双调蛋白的破骨细胞生成,使MM外泌体通过双调蛋白影响成骨细胞和破骨细胞在骨代谢中发挥作用[13]。致癌性NOTCH受体是MM细胞外囊泡传递物的一部分,并在细胞外囊泡的致癌能力中起关键作用,Giannandrea等[14]证明MM细胞外囊泡的刺激以NOTCH2依赖性方式增加破骨细胞的分化,干扰NOTCH2在MM细胞中的表达,会减少NOTCH2在骨髓瘤来源细胞外囊泡中的数量,并影响破骨细胞生成潜力。那么阻断NOTCH激活则可阻碍破骨细胞分化,这表明靶向NOTCH途径可能是治疗MM一个有效的策略,以此用于阻断细胞外囊泡在MM中的致癌作用。外泌体在MM细胞激活破骨细胞和抑制成骨细胞来触发骨溶解中起作用,其可激活pAkt通路来诱导破骨细胞的形成和活性,由MM细胞分泌于外泌体中的IL-32,在骨髓瘤骨髓缺氧环境下表达增加,在体内和体外均有促进破骨细胞活化的作用[15]。

Raimondi等[16]证明MM细胞外囊泡在小鼠巨噬细胞中通过S724磷酸化诱导未折叠蛋白反应信号分子IRE1α活化,使活化T细胞核因子c1(NFATc1)的转录被激活,触发破骨细胞分化。Wei等[17]证明氨基酰-tRNA合成酶相互作用多功能蛋白1(AIMP1)在体外通过激活NFATc1来促进破骨细胞的分化,然而AIMP1的外泌体包裹的小干扰RNA在体外和体内有效地抑制了破骨细胞分化。人骨髓瘤细胞系衍生的外泌体中的长链非编码RNA(lncRNA) RUNX2-AS1,能够与RUNX2前mRNA在重叠区域形成RNA双链,负调节RUNX2的表达抑制MSCs向成骨细胞分化,导致MSCs的成骨潜力下降[18],外泌体的RUNX2-AS1可作为MM骨病变的潜在治疗靶标。MM外泌体还通过激活Ape1/NF-kB通路触发BMSCs分泌IL-6,从而阻断BMSCs向成骨细胞分化,抑制成骨作用[19]。Faict S等[20]通过5TGM1小鼠模型试验证实了MM外泌体通过诱导DKK-1表达,使Runx2、Osterix 和胶原蛋白1A1表达减少,在增加破骨细胞的形成和活性的同时阻断成骨细胞分化。与冒烟型多发性骨髓瘤(state of smoldering MM, SMM)外泌体相比,MM外泌体中表达上调的miR-129-5p转移到MSCs,可抑制转录因子Sp1及其靶点碱性磷酸酶,从而阻断成骨细胞分化、抑制成骨[21]。然而新近研究却发现[22],树突状细胞来源外泌体(尤其是其亚型免疫调节型外泌体),能够抑制受体树突细胞的成熟和Th17效应物的诱导,促进调节性T细胞的招募,抑制骨吸收性细胞因子,减少破骨性骨质流失。由上可知,MM来源外泌体通过双调蛋白、pAkt通路、Ape1/NF-kB通路、IL-32、c-Met信号传导、S724磷酸化等途径,激活破骨并抑制成骨作用,促进MM骨病发生发展,然而处于免疫应答中心环节的树突状细胞,其来源外泌体具有抑制破骨作用,如在后续骨髓瘤骨病的治疗研究中靶向MM患者树突状细胞,使其分泌更多外泌体而减少破骨作用,这势必将给更多的骨病患者带来福音。

2.2 外泌体促进MM血管生成MM负担增加了骨髓的自然缺氧,骨髓缺氧环境可增加外泌体的生成,从而引发血管生成,血管生成被认为是MM进展的一个不变特征,对MM发病和发展至关重要。源自MM的外泌体含有高水平的miR-135b,当其转移到内皮细胞中,会抑制内皮细胞靶标缺氧诱导因子 (HIF)-1α,促进血管生成[23]。另外,作为MM外泌体货物蛋白的血管生成素、bFGF和VEGF等多种血管生成因子,可通过Stat3磷酸化诱导内皮细胞增殖和血管形成。MM来源的细胞外囊泡含有的piRNA-823转移到内皮细胞,通过增强 VEGF、IL-6 和 ICAM-1 的表达促进肿瘤增殖、侵袭和血管形成,当在异种移植模型中与MM细胞共同接种时,piRNA-823转染的内皮细胞可增强肿瘤生长[24]。

与未确定意义的单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy of undetermined signifi-cance, MGUS)患者外泌体相比,MM患者血清的外泌体能改变细胞内c-Src分布和促进NF-kB通路的激活,在内皮细胞中诱导更多的增殖[25]。用C6神经酰胺处理MM 细胞获得高水平的外泌体 miR-29b,可阻断内皮细胞中的PI3K-Akt通路来阻断血管形成[26]。用硼替佐米治疗的MM也出现了MM细胞外囊泡成分的改变,具有更多的促炎细胞因子和更少的促血管生成细胞因子,可抑制 NF-KB信号传导,导致增殖、迁移和血管形成的减少[27]。Giannandrea等[14]不仅证明MM来源细胞外囊泡对NOTCH2途径的刺激与破骨细胞的分化相关,还证实NOTCH2途径在刺激内皮细胞的血管生成发挥效应。那么在临床治疗中如果能靶向干扰NOTCH2途径,则可阻碍MM的血管生成潜力,以达到延缓MM进展的目的。另外,通过上述针对外泌体的研究可知,在骨髓瘤的不同疾病状态外泌体在量及内容物上的区别可为其作为预测指标奠定基础。

2.3 外泌体与MM其他组织器官损害肾脏是MM最易受累的器官之一,在一项针对MM合并肾损伤受试者的研究中发现,受试者外泌体中miRNA-140-3p、miRNA-185-5p、miRNA-425-5p、let-7c-5p和let-7d-5p含量明显偏低,且外泌体中miRNA的数量与临床特征相关标志物(如血肌酐、IL-6、β2-微球蛋白和b-CTX)的浓度相关[28],由此可知,外泌体在骨髓瘤肾损害中也具有相关性,鉴于目前这方面的研究较少,外泌体在骨髓瘤肾损害发生发展中的具体作用形式及机制需待更深入的研究。

MM所致心脏病变主要为继发于心脏淀粉样变性或贫血的严重心肌病和心力衰竭,部分为MM治疗药物对心脏功能的损伤,多项研究证明,高达50%的MM受试者出现心脏损伤。研究也证明增强的外泌体来源的circRNA可能导致 MM 相关的心肌改变,此外,聚合酶链式反应发现存在于MM 受试者血清外泌体中的circ-G042080的表达量与MM相关的心力衰竭具有相关性[29],外泌体circRNA可能是MM 相关心脏损伤诊断的新型生物标志物,并且可能是相关治疗靶点。

异基因造血干细胞移植经过半个多世纪的发展,已成为治愈恶性血液病的重要手段。MM患者使用造血干细胞治疗后,也同其他血液系统恶性肿瘤移植一样,面临感染、复发、移植物抗宿主病这三大影响生存率的主要问题。 Lia等[30]对41例接受异基因造血干细胞移植的MM患者进行的一项研究表明,CD146 (MCAM-1)与急性移植物抗宿主病(Acute Graft Versus Host Disease, aGVHD)风险正相关,而CD31和CD140-α(PECAM-1和PDGFR-α)与aGVHD风险负相关。除此之外,他们近期一项纳入32例患者的研究也证明抗原表达谱(如CD146、CD31、CD140a、CD120a、CD26、CD144和CD30),与aGVHD发病时的外泌体miRNA载体之间存在显著相关性[31],这表明外泌体抗原可作为MM骨髓移植治疗后aGVHD的可能标志物,在监测和预防aGVHD中起作用,而外泌体是否在慢性移植物抗宿主病中同样发挥作用还需待进一步研究。

3 外泌体作为MM生物标记物

目前没有任何手段可以预测MM的进展,骨髓检查作为血液系统肿瘤诊断、疗效评估及预测复发的诊断标准,对患者而言骨髓穿刺较外周血采集困难大、疼痛重、耗时长、费用贵,且单一部位骨髓检查不能反映MM的空间异质性,因此找寻更为简单、便捷、痛苦小、经济适用的MM诊断及治疗后监测手段成为亟待解决的问题。这时,一种针对体液中循环肿瘤生物标志物进行分析的新方法—“液体活检”映入研究者的眼帘,在各种循环肿瘤生物标志物中,外泌体因其在早期阶段高效诊断癌症的能力而备受关注。鉴于外泌体具有细胞类型特异性、稳定性和可从体液中获得性,外泌体可能为癌症诊断提供有前景的生物标记物,并可能代表癌症治疗的新靶点。MM的病因迄今尚未完全明确,而近年来外泌体作为一种新的通信方式备受关注。目前产生的影响MM细胞的最新分子是单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAb),包括抗 CD38 mAb、抗CD138 mAb、抗BCMA mAb和抗 SLAMF7 mAb,它们已用于MM患者的靶向治疗[32～34]。今后可以将不同的骨髓瘤靶向分子(例如抗CD138或抗BCMA mAb)设计到外泌体中,以将它们特异性地引导至MM细胞,以达到杀伤MM细胞抑制骨髓瘤发展的作用。

MM之前通常是无症状阶段的MGUS,15% 的MGUS患者将发展为 MM,有或没有SMM的中间状态。目前,骨髓恶性浆细胞百分比用于对MM患者进行分层,其中恶性浆细胞定义为 CD138+/CD38+,然而,CD138可以从膜上脱落,因而需要新的生物标志物来指导MM诊断和治疗后监测,而外泌体作为细胞间信息传递的中间环节,有明确的可能性被用作免疫球蛋白病进展的初步预测标志物[35, 36]。一项研究表明,血清外泌体来源的miRNA-20a-5p、miRNA-103a-3p 和 miRNA-4505的量,在MM患者、SMM和对照受试者中存在很大差异,外周血中CD138+骨髓瘤来源细胞外囊泡的水平也与MM骨病变的数量呈正相关,此外,与MGUS和SMM患者相比,MM患者的骨髓血清中更多的存在CD38+骨髓瘤来源细胞外囊泡[37]。Yu等[38]发现MM患者的外泌体circATP10A具有预测预后潜力,并与血管生成因子受体蛋白水平相关,表明其参与血管生成。起源于MYC基因的circRNA circMYC可以促进肿瘤细胞的生长,与正常对照组相比,MM受试者的血清外泌体circ-MYC的量明显增加,且circMYC 表达增加的MM受试者的总生存率和无进展生存期低于circMYC 水平降低的 MM 受试者[39]。外泌体 circMYC 浓度高是MM受试者预后不良的独立标志,外泌体circMYC水平较高的患者复发率较高,死亡率较高。这些已经被证明的或即将被证明的外泌体来源的RNA,可能是预测MM进展的可能新标志物,并且也可能是新治疗方法的目标。

4 总结与展望

总体而言,对外泌体的研究可增加我们对MM发病机制的了解,并为MM患者提供一种新的、有效的诊治思路。目前大多数外泌体在恶性血液病中的研究都是基于体外实验,对外泌体分泌途径的了解不足,MM衍生的外泌体对MM发生的直接作用仍有待在体内充分阐明。骨髓瘤外泌体可通过外周血获得,为MM治疗后疗效评估和复发预测使用外泌体提供便捷,在患者样本中发现肿瘤衍生的外泌体可以在尚未出现症状的早期诊断癌症,并显著提高治疗的成功率。随着对外泌体的关注,MM 来源外泌体相关研究的数量明显增加,尤其是评估小RNA,然而,目前对于哪种MM来源外泌体可作为的生物标志物,还没有在学术界到达共识。想要利用外泌体作为生物标志物、药物载体和疫苗,并对其进行合理的修饰,以进行治疗干预,对外泌体的进一步研究将探索其在转化医学中的潜力,为建立有效的临床诊断和治疗策略提供新的途径,这些将会是今后研究的方向。