前列腺癌EpCAM特异性分子探针的构建及其在体MR成像研究

仲津漫，丁健科，刘朵朵，陈欣，杨全新

前列腺癌是严重威胁男性健康的泌尿生殖系恶性肿瘤之一，约占前列腺恶性肿瘤的95%[1]。临床诊断前列腺癌的方法主要有直肠指检、血清前列腺特异性抗原测定以及超声、MRI等影像诊断方法，其中MRI具有极高的软组织分辨率，可以多方位、多参数成像，是目前公认的诊断前列腺癌理想的检查手段[2,3]。但对于早期前列腺癌，MRI诊断缺乏特异性，易与一些前列腺良性病变相混淆。近年来，基于细胞分子水平的靶向对比剂研究逐渐成为热点。

上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一种跨膜糖蛋白，在正常上皮细胞中表达极低[4]。研究表明EpCAM在前列腺癌及癌旁组织中均呈过表达，且表达水平与前列腺癌的术前和术后Gleason评分呈正相关，与无复发生存率呈负相关。过表达EpCAM可显著增强前列腺癌细胞增殖、侵袭的能力[5,6]。金磁纳米微粒是一种以氧化铁为核心，表面被覆金作为壳的新型核/壳结构复合微粒[7]，不仅具有胶体金的光学性质和偶联性能，还兼具超顺磁性氧化铁核心的磁响应性及其衍生的分离纯化能力，在MR分子影像学中具有极大的应用前景。本研究利用GoldMag金磁纳米微粒的理化性质，将其与本课题组先前制备的EpCAM特异性核酸适配体Ep1[8]偶联，构建分子探针Ep1-GoldMag，检测其对EpCAM阳性的前列腺癌细胞的靶向亲和性，进一步探讨其在活体内MR成像的可行性，为前列腺癌的早期靶向诊疗研究奠定实验基础。

材料与方法

1.主要仪器和试剂

人前列腺癌细胞系LNCap、PC-3以及人正常前列腺基质细胞系WPMY-1购自中国科学院上海生命科学研究所细胞库；核酸适配体Ep1在本人研究生期间的课题实验中已成功制备并保存；DMEM、RPMI-1640培养基购自Gibco公司；进口胎牛血清购自ZETA LIFE公司；GoldMagTM-CS金磁纳米微粒试剂盒购自西安金磁纳米生物有限公司；其他试剂均为进口分装或国产分析纯试剂。

其他仪器还包括磁性分离器(西安金磁纳米生物技术有限公司)、FACS Calibur流式细胞仪(BD美国)、荧光显微镜及照相系统(Olympus日本)、激光共聚焦荧光显微镜(Nikon日本)、紫外分光光度计(Bio-Rad公司)、3.0T磁共振扫描仪(Siemens Magnetom Tim Trio 3.0 T MRI)。

2.核酸适配体在金磁纳米微粒表面的固定化效率检测

将100 μL 1 mg/mL GoldMagTM-CS金磁纳米微粒悬液加入500 μL偶联缓冲液振荡混匀，磁性分离5 min。将Ep1分别稀释成0 μg/μL、20 μg/μL、40 μg/μL、60 μg/μL、80 μg/μL、100 μg/μL、120 μg/μL、140 μg/μL、160 μg/μL等一系列浓度，加入偶联缓冲液混匀，留取部分Ep1溶液标记为pre。将余下Ep1溶液重悬上述磁性分离后的金磁纳米微粒，37℃孵育1 h，磁性分离后留取上清液，标记为post。加入1000 μL PBST缓冲液洗涤、重悬偶联产物，磁性分离，留取部分上清液，标记为wash，以PBST缓冲液作为空白对照，分别测量pre、post和wash样品在260 nm处的吸光度值(optical density,OD)，用如下公式计算Ep1在金磁纳米微粒表面的固定化效率：固定化效率(%)=(ODpre-ODpost-ODwash)/ODpre×100%。

3.分子探针Ep1-GoldMag-tBid构建

将100 μL金磁纳米微粒悬液加入500 μL偶联缓冲液充分振荡混匀，磁性分离5 min，弃上清。将40 μg核酸适配体Ep1加入500 μL偶联缓冲液充分混匀，并以此重悬上述磁性分离后的金磁纳米微粒溶液，37℃孵育30 min后磁性分离。洗涤后再加入封闭缓冲液封闭1 h，PBS重复洗涤后磁性分离，所得沉淀即为目的分子探针Ep1-GoldMag。用同样方法制备ssDNA-GoldMag作为阴性对照组。

4.免疫荧光实验检测Ep1-GoldMag的细胞特异性

将LNCap、PC-3及WPMY-1细胞分别接种于20 mm激光共聚焦培养皿中培养，待细胞生长至培养皿底面积约75%时，吸弃上清液，PBS洗涤，向培养皿中加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，50 g/L BSA室温封闭1 h，用PBS洗涤后加入200 pmol FAM标记的分子探针Ep1-GoldMag溶液，置于4℃避光孵育8 h，再加入DAPI室温避光孵育10 min衬染细胞核，PBS重复洗涤后封片，用激光共聚焦荧光显微镜观察各细胞的荧光显示比例。

5.前列腺癌荷瘤裸鼠模型构建

制备前列腺癌PC-3细胞悬液，调整其浓度为5×106/200 μL。4～6周龄Bab/c雄性裸鼠(体重范围：14.5～21.0 g)12只，随机分为两组，每组各6只，每只裸鼠右侧皮下注射瘤细胞悬液200 μL，隔天追加注射200 μL/只1次，置于SPF级环境饲养，隔日观察并记录裸鼠及其肿瘤的生长情况。在相同条件下实验重复3次。

6.检测EpCAM在前列腺癌荷瘤裸鼠肿瘤及重要脏器组织中的表达

待荷瘤裸鼠肿瘤平均直径达0.8～1.0 cm时，将裸鼠麻醉后脱臼处死，取其肿瘤及心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织浸泡于4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成石蜡组织块，切片后依次经过烘烤、脱蜡复水、抗原修复、封闭，向组织切片加入兔抗人EpCAM抗体4℃孵育过夜，再加入兔超敏二步法免疫组化检测试剂室温孵育20 min，洗片后加入Poly-HRP anti-Rabbit IgG，室温孵育20 min，再用DAB溶液显色。用苏木素染核5 min，依次经过分化、返蓝、脱水、透明，用中性树脂封片，加盖盖玻片封固，在光学显微镜下观察、取照。

7.组织免疫荧光实验检测Ep1-GoldMag的组织特异性

将50 μL FAM标记的Ep1-GoldMag经内眦静脉注入裸鼠体内，随后将裸鼠麻醉后脱臼处死，取其肿瘤及心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织迅速冷冻，OCT包埋后制备冰冻组织切片。加入5% BSA室温封闭1 h，用DAPI染核，甘油-灭菌双蒸水封片，在激光共聚焦荧光显微镜下观察、取照。

8.前列腺癌荷瘤裸鼠MR特异性成像

将裸鼠麻醉后置于西门子3.0T MRI小动物专用线圈进行MRI扫描，采用俯卧位、头先进、T2WI冠状位方向扫描，扫描参数：TR 7400 ms，TE 66 ms，视野200 mm×200 mm，层厚2.0 mm，层数15，翻转角150°，平均采集次数4次。将50 μL Ep1-GoldMag经裸鼠内眦静脉注入其体内，分别在注射后1 h、6 h及12 h对裸鼠行MRI扫描，体位和扫描参数均与注射前MRI扫描相同。扫描完成后对图像和数据进行后处理，测量裸鼠肿瘤的信号强度。采用Graph Pad Prism 6.0软件进行统计学分析，利用One-way Anova和t检验比较各组裸鼠肿瘤在注入分子探针前后不同时间点的信号强度差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.核酸适配体Ep1在金磁纳米微粒表面的固定化效率

采用紫外分光光度计检测Ep1在金磁纳米微粒表面的固定化效率，结果显示随着加入Ep1的含量逐渐增加，其在金磁纳米微粒表面的固定化效率逐渐下降(图1)。当Ep1加入40 μg时，其在金磁纳米微粒表面的固定化效率约为92%，当Ep1加入50 μg时，其在金磁纳米微粒表面的固定化效率约为86%。

2.Ep1-GoldMag的细胞特异性检测

将Ep1-GoldMag分别与LNCap、PC-3和WPMY-1细胞孵育后，采用激光共聚焦荧光显微镜观察荧光在细胞的分布情况，结果显示与Ep1-GoldMag作用的两种EpCAM阳性的前列腺癌细胞膜上均可见明显的绿色荧光，而与对照组ssDNA-GoldMag作用的细胞膜上未见明显绿色荧光显示(图2)，结果表明Ep1-GoldMag具有良好的EpCAM靶向亲和性。

图1 核酸适配体Ep1在金磁纳米微粒表面的固定化效率。 图2 激光共聚焦荧光显微镜观察Ep1-GoldMag的细胞特异性。

3.EpCAM在前列腺癌荷瘤裸鼠肿瘤及重要脏器组织中的表达

用免疫组织化学染色实验检测前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织中EpCAM的表达情况。结果显示，荷瘤裸鼠肿瘤组织中EpCAM呈高表达，而心、肝、脾、肺、肾等脏器组织中EpCAM表达不明显(图3)。

图3 免疫组化染色检测前列腺癌荷瘤裸鼠肿瘤组织及其重要脏器组织中EpCAM的表达。 图4 激光共聚焦荧光显微镜观察Ep1-GoldMag的组织特异性。

4.Ep1-GoldMag的肿瘤组织特异性检测

将50 μL分子探针经内眦静脉注入裸鼠体内，随后将裸鼠麻醉后予以脱臼处死，分别取其肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾等重要脏器组织制成冰冻组织切片。采用组织免疫荧光实验检测Ep1-GoldMag在裸鼠肿瘤组织及重要组织器官的分布情况。结果显示Ep1-GoldMag可以特异性集聚于荷瘤裸鼠的肿瘤组织，而在心、肝、脾、肺、肾等重要组织脏器中未见明显分布(图4)。

5.Ep1-GoldMag对前列腺癌荷瘤裸鼠的MR特异性成像

对荷瘤裸鼠行MRI扫描，随后将Ep1-GoldMag经内眦静脉注入其体内，分别在注射后1 h、6 h和12 h对裸鼠再次行MRI扫描。结果显示注入Ep1-GoldMag 1 h后，肿瘤组织T2WI信号明显减低，注入6 h后肿瘤组织T2WI信号持续减低，注入12 h后肿瘤组织T2WI信号强度略有升高，但与注射前相比仍呈明显低信号；而ssDNA-GoldMag注射前后T2WI信号强度未见明显减低(图5a)，实验组与对照组在分子探针注入后各时间点之间的信号强度差异均具有统计学意义；此外，实验组内部注射前与注射后各时间点的信号强度差异均具有统计学意义(图5b，表1、2)，实验结果表明Ep1-GoldMag可以在体内特异性靶向并结合EpCAM阳性的前列腺肿瘤组织，并使其在MR上成像。

图5 Ep1-GoldMag注射前与注射后1h、6h和12h前列腺癌荷瘤裸鼠的MR成像。a) 注入分子探针Ep1-GoldMag 1h后进行MRI扫描，可见裸鼠肿瘤组织T2WI信号强度明显减低，注入分子探针6 h后，肿瘤组织T2WI信号强度进一步减低，注入分子探针12h后，肿瘤组织T2WI信号强度略有回升，但与注射前相比仍呈明显低信号，而对照组分子探针ssDNA-GoldMag注射前后肿瘤组织T2WI信号强度未见明显减低; b) 箱式图显示Ep1-GoldMag实验组与ssDNA-GoldMag对照组两组之间的T2WI信号强度差异具有统计学意义。

表1 实验组与对照组在注入分子探针前后不同时间点的肿瘤T2WI信号强度比较

表2 分子探针2组1h、6h和12h裸鼠肿瘤T2WI信号强度比较

讨 论

前列腺癌是中老年男性最常见的泌尿生殖系恶性肿瘤之一。传统的治疗手段如手术多适用于早期前列腺癌。内分泌治疗是进展期前列腺癌最有效的治疗方法，但在历经2～3年的有效期，病情终将进展为雄激素非依赖性难治阶段，使内分泌治疗失效，患者预后较差[9]。因此，早期发现并准确诊断前列腺癌对于改善患者预后、延长生存期至关重要。

与传统的影像学相比，新兴的分子影像学是将分子生物学等基础学科引入到影像医学领域中来，可以从细胞分子层面探查疾病在活体的发展过程[10]。MRI以其高软组织分辨率及成像参数多元化而成为理想的分子影像学诊断媒介[11-13]，但其特异度和灵敏度相对较低。通过寻找具有磁响应性的MR对比剂，再联合核酸适配体的高亲和力特性可以制备兼具特异性靶向病灶并使其MR成像的分子探针，为肿瘤的靶向诊断和精准治疗提供了新方法。

在先前的研究中[8]，本课题组利用细胞指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术已成功制备靶向EpCAM分子的特异性核酸适配体Ep1，并通过一系列实验验证了Ep1对EpCAM阳性组织细胞的特异性和亲和性，为下一步分子探针的构建奠定了实验基础。

超顺磁性氧化铁纳米微粒(super paramagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)是一类新型的纳米级材料，具有良好的超顺磁性、生物相容性、生物降解性以及表面特性[14]，在生物医学领域如肿瘤细胞MRI显像等方面应用前景广阔。基于其超顺磁性的物理特性，SPIONs可以明显缩短T2和T2*驰豫时间，从而降低SPIONs聚集处组织细胞的MR信号强度[15]。SPIONs对MR驰豫性能的影响主要由磁铁矿芯的尺寸、组成、结晶度和表面被覆涂层等物理化学性质决定。增大SPIONs直径以及在其表面涂覆聚合物涂层均可增加T2驰豫性能、增加组织中SPIONs的局部浓度、降低背景组织产生的信号噪声[16]。本研究采用的GoldMag金磁纳米微粒以氧化铁为主体，本质上属于SPIONs，具有超顺磁性氧化铁的磁响应性能[17]。为了权衡尺寸及其MR成像驰豫性能，本研究采用的金磁纳米微粒直径约40～50 nm，这种金磁纳米微粒在表面涂覆了金被膜，可以在保证MR成像质量的同时兼具偶联性能。经过固定化效率检测，1 mg金磁纳米微粒表面可偶联约40 μg核酸适配体Ep1，可满足本实验偶联微量核酸适配体的需要。

分子探针进入体内以后，在血循环中需要有合适的清除期，以便既能有效成像，又不会产生高本底。先前一系列小动物活体MR成像研究显示，在注射对比剂后平均2～5 h左右，目标病灶呈现明显的特异性强化，延迟成像时间可达20 h[18,19]。本研究分别选择在注射后1 h、6 h以及12 h对荷瘤裸鼠行MRI扫描，发现早在对比剂注入1 h时，病灶已有明显信号改变，6 h后病灶特异性显像更为显著，延迟至12 h，虽然信号强度较6 h时有所回升，但仍呈现特异性强化，与注入对比剂前相比有统计学差异。

本研究制备的分子探针Ep1-GoldMag具有良好的理化性能，不仅具有EpCAM组织细胞特异性，还能使前列腺癌EpCAM荷瘤裸鼠在MR上特异性成像，但对于其生物相容性、半衰期及代谢途径等药代动力学特性还有待进一步研究。