基于UPLC-Q-TOF-MS技术和PLS-DA分析的五个基原绿绒蒿化学成分差异研究

李玉凰，王云红，张成江，郭延垒，秦伟瀚，刘 翔*，阳 勇*

1重庆市中药研究院，重庆400065；2遵义医科大学药学院，遵义563000

藏药是我国四大民族药之首，其特殊的地理环境造就了藏药材独特的治疗效果[1]。绿绒蒿作为常用的藏药，在《新修晶珠本草》《民族药辞典》《藏药部颁》《国家藏药标准全书》《藏药志》等藏药典籍中均有记载。绿绒蒿属(MeconopsisVig.)是Viguier于1814年根据康布里罂粟Papavercambricum建立的，是极具特色的高山藏药，本属分2个亚属、5个组和9个系，间断分布于东亚和西欧，为一年生或多年生草本，株高10～180 cm不等，种类不同，花型花色各不相同，绿绒蒿中的不少种类茎叶上长满了柔长的绒毛，因此得名[2-4]。因南北学用药不一，各地绿绒蒿属植物在使用上和名称上有所异同，导致药物混淆，品种混乱、基原复杂，故绿绒蒿属药用植物的研究和应用面临挑战[5,6]。

超高液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)具有高分辨率、高灵敏度和高效分离能力，可在缺少对照品的情况下对复杂中药成分进行初步定性分析，已被广泛用于天然药物分析[7,8]。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS对总状绿绒蒿MeconopsisracemoseMaxim.、多刺绿绒蒿MeconopsishorridulaHook.f.&Thoms、五脉绿绒蒿MeconopsisquintuplinerviaRegel、全缘叶绿绒蒿Meconopsisintegrifolia(Maxim).French.和红花绿绒蒿MeconopsispuniceaMaxim.5个基原共49个批次绿绒蒿药材的化学成分进行鉴定，结合主成分分析(principal component analysis，PCA)及偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination-analysis，PLS-DA)数学模型探讨不同基原绿绒蒿成分差异，为绿绒蒿品种分类、物质基础和合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

TripleTOF 4600型四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪(美国，ABSCIEX公司)：Peak View 1.2数据处理软件；SIMCA-P 14.1(瑞典，Umetrics公司)。

1.2 试药

甲醇(分析纯，批号：202010101，重庆川东化工(集团)有限公司)；乙腈(色谱纯，批号：1100130025，Merck)；甲酸(色谱纯，批号：202674，Fisher)；水(色谱纯，批号：197545，Fisher)。

1.3 药材

本实验用绿绒蒿全草药材经重庆市中药研究院生药所刘翔副研究员采集鉴定，采集信息表见表1。

表1 绿绒蒿样品信息Table 1 Sample information of Meconopsis

续表1(Continued Tab.1)

1.4 供试品溶液制备

取样品粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理，(功率100 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液即得。

1.5 分析方法

1.5.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相A为甲酸水溶液(0.1%)，流动相B为乙腈，梯度洗脱(0～3.0 min，30% B；3.0～11.0 min，30%→90% B；11.0～12.8 min，90% B；12.8～13.0 min，90%→10% B；13～15.0 min，10% B)；柱温30 ℃；流速0.25 mL/min；进样量3 μL。

1.5.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，分别在正、负离子模式下扫描，扫描范围m/z：100～1 000；离子源温度(TEMP)：600℃；正、负离子模式下喷雾电压(IS)分别为+5.5、-4.5 kV；碰撞能量(CE)：10 eV；碰撞能量叠加(CES)：25±15 eV；去簇电压(DP)：100 V；气帘气压力(CUR)：25 psi；雾化气压力(GS1)：55 psi；辅助气压力(GS2)：55 psi；采集时间15 min。

1.6 数据处理方法

通过中国知网(CNKI)、SciFinder、PubChem、ChemSpider 等平台或数据库查询绿绒蒿属药材中所含的化学成分，建立绿绒蒿成分的质谱数据库，包含化合物名称、分子式、结构、质谱信息等。将供试品溶液按“1.5.1”和“1.5.2”项下条件检测，结合前期建立的绿绒蒿成分质谱数据库，应用Peak View 1.2软件中的 XIC Manager功能进行化合物初步的筛选，得化合物的分子离子峰、二级碎片离子信息及保留时间等信息，根据文献资料、化合物Mol式匹配结果、质谱数据库结合软件的Formula Finder、Mass Calculators、Fragment Matching 等功能以及二级碎片裂解规律进行定性分析，进行化合物的鉴定。

1.7 PCA、PLS-DA数据处理方法

将49批绿绒蒿供试品溶液的数据结果导入 PeakView 1.2 软件，将满足误差小于5 ppm，同位素分布正确且含有二级碎片的化合物确认为目标物质，结合PeakView 1.2软件Formula Finder等功能、数据库及二级碎片裂解规律，对绿绒蒿所含成分进行定性分析，并按化合物类别建立已知成分筛查表。将5个基原绿绒蒿的MS数据用notepad++软件打开编辑后，转换数据，在正离子模式下得到1 811组化合物相关数据，负离子模式下得到1819组化合物相关数据。将处理后的数据导入SIMCA-P 14.1软件中，运用模式识别技术进行数据的可视化处理，构建PCA及PLS-DA数学模型。从整体到部分，全面分析5个基原绿绒蒿的化学成分差异、分组趋势和相关性。

2 结果与分析

2.1 5个基原绿绒蒿中化学成分的质谱解析

通过检测，得总离子流图(TIC)，并以5个基原绿绒蒿各1个代表性样品的TIC图作代表性数据(见图1)。结果发现多刺绿绒蒿、总状绿绒蒿、五脉绿绒蒿、全缘叶绿绒蒿、红花绿绒蒿的色谱图具有一定差异性。通过对5个基原绿绒蒿在正、负离子模式下碎片离子进行对比，在正离子模式下鉴定得到了65个化合物，在负离子模式下鉴定得到了65个化合物，共鉴定出75个化合物(见表2)，其中包括生物碱类化合物16个，黄酮类化合物26个，挥发油类化合物24个，其他化合物9个。其中二氢血根碱、去甲血根碱、原阿片碱、马齿苋酰胺、芹菜素、木犀草素、槲皮素、白屈菜碱、苜蓿素等43个化学成分为5个基原绿绒蒿中的共有成分；桂皮酰胺、阿扑吗啡、原荷包牡丹碱、威尔士绿绒蒿定碱、脉奎宁、槲皮素-3-O-[2-O-乙酰基-α-L-阿拉伯糖(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-[2-O-乙酰基-α-L-阿拉伯糖( 1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷、2-胺基-苯甲酸甲酯、二十一酸甲酯、豆甾-3,5,22-三烯、二氢刺苞菊醛、5,15-O-diacetyl-3-O-phenyl-6 ( 17 ) epoxylathyrol等在5个基原绿绒蒿中存在明显差异，各批次绿绒蒿化学成分差异(见表3)。

图1 不同基原绿绒蒿样本UPLC-Q-TOF-MS正离子和负离子模式总离子流图Fig.1 UPLC-Q-TOF-MS total ion chromatograms for different origins of Meconopsis under positive ion and negative ion注：A：多刺绿绒蒿；B：总状绿绒蒿；C：五脉绿绒蒿；D：全缘叶绿绒蒿；E：红花绿绒蒿。Note:A:M.horridula;B:M.racemose;C:M.quintuplinervia;D:M.integrifolia;E:M.punicea.

表2 5个基原绿绒蒿样品中化学成分分析Table 2 Analysis of chemical constituents in five origins of Meconopsis

续表2(Continued Tab.2)

续表2(Continued Tab.2)

续表2(Continued Tab.2)

续表2(Continued Tab.2)

表3 49个批次绿绒蒿的化学成分对照Table 3 Chemical composition control of 49 batches of Meconopsis

续表3(Continued Tab.3)

续表3(Continued Tab.3)

续表3(Continued Tab.3)

续表3(Continued Tab.3)

2.2 主成分分析(PCA)

基于对上述5个基原绿绒蒿TIC图的观察和化学成分比较，为进一步明确5个基原绿绒蒿的差异，以PCA建立不同基原绿绒蒿的分散点图进行整体趋势分析观察。将5个基原绿绒蒿的MS数据用notepad++软件打开编辑后，转换数据，将处理后的数据导入SIMCA-P 14.1软件中进行无监督的PCA处理(见图2)，结果表明5个基原绿绒蒿不能各自明显分离，正离子模式下多刺绿绒蒿和总状绿绒蒿较好地聚集在一起，五脉绿绒蒿、全缘叶绿绒蒿和红花绿绒蒿能较好地聚集在一起；负离子模式下5个基原绿绒蒿各批次较为分散，提示不同基原绿绒蒿的化学成分存在一定的差异性。

图2 不同离子模式下5个基原绿绒蒿的PCA得分Fig.2 PCA scores of five origins of Meconopsis under different ion modes

2.3 偏最小二乘法-辨别分析(PLS-DA)

基于上述TIC和PCA结果，为充分了解5个基原绿绒蒿间的差异信息，将处理后的数据进一步进行PLS-DA模式识别，结果发现在正、负离子模式下多刺绿绒蒿和总状绿绒蒿均能较好地聚集在一起；五脉绿绒蒿、全缘叶绿绒蒿和红花绿绒蒿较为分散，但仍存在一定交集，见图3。由此可得，5个基原绿绒蒿存在差异性化学成分，可将多刺绿绒蒿和总状绿绒蒿分为一类，与其余3个基原绿绒蒿明显区分开。

图3 不同离子模式下5个基原绿绒蒿的PLS-DA得分Fig.3 PLS-DA scores of five origins of Meconopsis in different ion modes

3 讨论与结论

《中华人民共和国卫生部药品标准(藏药)》1995年版中，分别收载了多刺绿绒蒿和绿绒蒿两个品种，多刺绿绒蒿的来源仅1种，绿绒蒿的来源有3种：全缘绿绒蒿、五脉绿绒蒿、长叶绿绒蒿，但市场调研发现，在藏区实际应用中长叶绿绒蒿品种较少，资源较为匮乏。据报道，绿绒蒿属植物因生长环境恶劣和人类过度开采等原因，导致绿绒蒿资源有限，部分绿绒蒿已处于濒危状态，作为我国濒危保护植物[9,10]。因而对藏药绿绒蒿进行深入研究，对品种进行整理分类，为绿绒蒿的合理开发与应用具有重要的作用。

药物的不同临床作用很大程度上是由于化学成分的不同导致的。根据文献报道[11-16]，绿绒蒿属植物中含有生物碱类、黄酮类、挥发油类、甾体类、萜类等化学成分，其中生物碱和黄酮为其主要活性成分[17]，是近年来研究的重点。有专家提出在《中华人民共和国卫生部药品标准(藏药)》刺尔恩的来源中增加总状绿绒蒿这一基原，但尚未有研究报道支持此建议。本研究首次通过质谱手段对5个基原绿绒蒿的化学成分进行研究，基于本研究中鉴别出的75种化学成分，多刺绿绒蒿与总状绿绒蒿有59种共有化学成分，表明多刺绿绒蒿与总状绿绒蒿的化学成分种类上基本一致，与其他3个基原的绿绒蒿化学成分种类存在一定差异，此研究结果可为多刺绿绒蒿中增加总状绿绒蒿这一基原提供科学依据。

在物质基础方面，5个基原绿绒蒿的化学成分差异可能会对该药材的药效产生较大影响，建议将多刺绿绒蒿和总状绿绒蒿归为一类，多刺绿绒蒿的来源中增加总状绿绒蒿；五脉绿绒蒿、全缘绿绒蒿、红花绿绒蒿各分为一类；在实际应用中不可将五脉绿绒蒿、全缘绿绒蒿、红花绿绒蒿与多刺绿绒蒿混用，注意区分。目前，绿绒蒿种类复杂，基原混乱，其具有极大的种类差异，在品种分类和研究应用方面需要给予更多的关注。本研究从物质基础角度分析了5个基原绿绒蒿的差异性，差异性成分可考虑作为不同基原绿绒蒿的品种鉴别的参考依据，后续将对5个基原绿绒蒿之间的差异性成分进行详细分析，也将从药理和临床应用方面对这5个基原绿绒蒿的差异作进一步研究。