牛结节性皮肤病疫苗研究进展

李 林，巩明霞，迟田英，王英丽，于小静，杜秋明，南文龙，陈义平，王志亮

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.延边州动物疫病预防控制中心，吉林延吉 133400）

牛结节性皮肤病（lumpy skin disease，LSD）是由牛结节性皮肤病病毒（lumpy skin disease virus，LSDV）引起牛全身性感染的急性、亚急性或慢性传染病。该病主要通过吸血媒介昆虫机械传播，也可以通过污染的饲料和水等直接或间接传播。LSD 发病率受许多因素影响（如养殖条件、免疫状态和虫媒密度等），变动范围较大，死亡率较低。所有品种的牛，不论年龄和性别都会受到影响，其中哺乳期犊牛更为严重。一些野生动物如长颈鹿、羚羊和跳羚等，也可以感染LSDV。LSDV 是双链DNA 病毒，属于痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒属（Capripoxvirus，CaPV），同属的病毒还包括山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）和绵羊痘病毒（sheeppox virus，SPPV）[1]。LSD 典型特征是在皮肤上形成结节，从而导致牛皮受损，还可造成产奶量下降、流产、不育等，少数发病牛最终因严重感染死亡，还因牛的流动和贸易限制造成间接损失，对养牛业产生重大经济影响，因此LSD 被世界动物卫生组织列为法定通报疫病，在我国被确定为二类动物疫病。

LSD 最早于1929 年发现于非洲赞比亚，其后在非洲多个国家流行，1957 年首次证实由LSDV引起。自2012 年起，该病由中东传播至欧洲东南部，并持续蔓延到高加索和巴尔干地区以及俄罗斯和哈萨克斯坦等国家。2019 年以来，南亚、东亚和东南亚等地区相继暴发LSD[2-10]。我国于2019 年8月首次确诊新疆维吾尔自治区伊犁州发生LSD 疫情，此后疫情波及安徽、福建、江西、广东和浙江等十余个省份。有效的疫苗免疫配合其他控制措施是控制和消灭LSD 最有效的方式。本文着重介绍了国内外常用LSD 疫苗的种类、副作用及其免疫效果和质量控制，以期为该病控制和消灭提供技术支持。

1 疫苗种类

目前只有弱毒活疫苗（LAV）用于预防LSD：第一类为基于LSDV 毒株的弱毒同源疫苗，包括Neethling 株疫苗和KGSP 株疫苗；第二类为非LSDV 毒株的弱毒异源羊痘疫苗，包括山羊痘疫苗（Kedong、Gorgan 和AV41 株等）和绵羊痘疫苗（Yugoslavian RM65、罗马尼亚株和Bakirköy株等）。

1.1 弱毒同源活疫苗

同源疫苗能为牛提供很好的保护，免受毒力较强的野毒侵袭。国外常用的这类疫苗包括由南非Neethling 株以及肯尼亚绵羊和山羊痘病毒（Kenyan sheep and goat pox virus，KSGP）KSGP O-240 株和KSGP O-180 株为种毒的一系列疫苗。

1.1.1 Neethling 毒株疫苗 Neethling 原型毒株（Neethling-WC/RSA/1957）分离自1957 年南非Western Cape 省的一起疫情。为了在牛身上安全地使用，通过大量传代来致弱LSDV 野毒株毒力。先在羔羊肾（LK）细胞中连续传代61 代，而后在鸡胚绒毛尿囊膜上传代20 代，又在LK 细胞中传代3 代，最终获得减毒疫苗表型毒株（LW-1959）。自20 世纪60 年代以来，南非一直使用Neethling/vaccine/LW1959 毒株疫苗来控制该病。目前该毒株在不同的公司有多种衍生疫苗，如OBP（南非Onderstepoort Biological Products 公司）、Herbivac LS（南非Deltamune 公司）和Bovivax（摩洛哥MCI Sante Animale 公司）是基于Neethling 株的LSD 疫苗，而Lumpyvax®（南非MSD 公司）是基于SIS Neethling 毒株的疫苗。通过对Lumpyvax、Herbivac LS 和OBP 等疫苗毒株的全基因组测序，3 个毒株与Neethling 疫苗LW 1959 株基因组之间有99.9%的同源性[11]。这3 个疫苗株与LW 1959毒株的不同之处在于有2 个氨基酸修饰和2 个不影响编码序列的单核苷酸缺失。在LW037（G/V）基因上，Lumpyvax 和Herbivac LS 都有额外的氨基酸差异。此外，Herbivac LS 显示出2 个单核苷酸缺失，其中1 个缺失会导致LW134a基因的移码。OBP 在末端非编码区包含1 个18 nt 缺失和另外3个不影响编码序列的单核苷酸插入/缺失[12]。

1.1.2 KSGP 毒株疫苗 除Neethling 毒株疫苗外，另两种同源性疫苗为KSGP O-240 和KSGP O-180疫苗。这些疫苗已在埃塞俄比亚、以色列和埃及等几个国家用于预防LSD。KSGP O-240 和KSGP O-180 这两个毒株都来自绵羊，均可感染绵羊和山羊，毒株之间没有太大差异，只是分离时间不同[13]。区别在于KSGP O-180 分离株通过在胎牛肌肉细胞中传代18 代获得，而KSGP O-240 株在细胞中仅传代6次获得。还有1种KS-1毒株（Kenyan sheep pox）疫苗是从KSGP 疫苗衍生而来的。KSGP 毒株疫苗多年来已被广泛用于预防山羊痘和绵羊痘[14]。虽然这些毒株的名称指的是SPPV 和GTPV，但KSGP 和KS-1 毒株的真正身份已被证实为LSDV 毒株[14-15]。

1.2 弱毒异源活疫苗

LSDV 基因组与SPPV 和GTPV 非常相似，有97%的核苷酸同源性。羊痘病毒属的3 种病毒在血清学上彼此无法区分，能够诱导异源交叉保护，因此异源疫苗（山羊痘疫苗和绵羊痘疫苗）也被用于防控LSD。虽然同源疫苗（Neethling 疫苗或KSGP 疫苗）能给牛提供良好的保护，但疫苗免疫时会出现一些温和的副反应，而羊痘疫苗在牛身上通常不会引起副反应。另外，羊痘疫苗的优势是价格相对便宜，尤其是在羊痘流行的国家。对于那些没有同源疫苗但又同时流行LSD、绵羊痘和山羊痘的国家，出于经济和安全性原因，一些国家倾向于使用异源弱毒疫苗来预防控制LSD 传播。

已经用于LSD 防控的山羊痘疫苗包括Kedong株、Gorgan 株、G20-LKV 株以及国内使用的AV41 株山羊痘疫苗[16]。目前使用的绵羊痘疫苗包括Yugoslavian RM65 株、Bakirköy 株和罗马尼亚绵羊痘病毒（Romanian SPPV）疫苗等[17-18]。

2 正在研究中的疫苗

目前还没有商品化的灭活LSDV 疫苗。普遍的观点认为，灭活疫苗需要多次免疫才能产生良好的保护作用。近年来，出于对同源活疫苗副作用和出现重组病毒的担心，灭活疫苗获得了更多关注并显示出替代LAV 的潜力[19-20]。摩洛哥研制了一种以Neethling 株为基础的油佐剂灭活疫苗，在保加利亚进行了临床试验。结果发现：该疫苗很安全，未引起任何不良反应；从接种后第7 天开始产生高水平的特异性抗体，诱导保护作用与活疫苗相似，完全保护强毒株攻毒。此外，临床研究证实了该疫苗的安全性和有效性。该疫苗在长达1 年的时间里没有表现出任何不良反应，并诱导了高水平的抗体[19]。另一项研究[21]发现，一种低分子量共聚物佐剂疫苗配方可为免疫动物遭受强毒感染提供保护。该发现有力支持了针对LSDV 感染时使用灭活疫苗的可能性，并表明所选择的佐剂对保护效果有显著影响。

LDSV 基因组较大，可以作为重组亚单位疫苗的骨架。基于LSDV 的载体系统已经被广泛用于构建携带其他病毒（如蓝舌病病毒、裂谷热病毒和牛流行热病毒等）保护性抗原的重组疫苗，其中许多已经证明能诱导有效的免疫保护，可实现一种疫苗预防多种疫病[22-25]。

3 疫苗免疫效果

3.1 弱毒同源疫苗

疫苗在过去几十年间被广泛应用于预防LSD，其中Neethling 疫苗应用范围最广，时间最长。2012—2013 年以色列[18]、2014—2015 年塞浦路斯[26]以及2016—2017 年欧洲东南部，通过使用同源Neethling 疫苗进行大规模免疫接种成功控制了LSD 疫情，证明了同源减毒活疫苗具有良好的临床应用效果[27-28]。对欧洲巴尔干地区6 个国家免疫Neethling 疫苗后的结果总结发现，该疫苗对于预防LSD 具有很高的有效性。这6 个国家的疫苗效力（vaccine effectiveness，VE）平均为79.8%（95%CI：73.2%～84.7%），阿尔巴尼亚最低，为62.5%，保加利亚和塞尔维亚最高，均超过97%。从接种疫苗到形成保护性免疫的时间分析表明，VE 主要发生在接种后的前14 d[28]。

欧盟LSD 参考实验室使用攻毒试验，对5 种商品化弱毒同源活疫苗效力进行了评估[29]，结果发现：在标准条件下，所评估的5 种疫苗都能有效保护动物免受强毒LSDV 攻击；除了血清学反应的微小差异外，疫苗之间的副作用也有部分差异，如局部反应和接种疫苗时的Neethling 反应。近年来发现，KSGP 疫苗不适合用于防控LSD。埃塞俄比亚采用的KS1 O-180 疫苗在保护牛群免受LSDV侵害方面效果较差，无论是直接的临床保护还是减少传播[30]。这都意味着需要提高疫苗质量或开发有效的替代疫苗，以对LSD 提供良好保护。

3.2 弱毒异源疫苗

近年来的研究表明，山羊痘疫苗能给牛提供与LSDV 同源疫苗相同的保护作用[16]。2015 年埃塞俄比亚使用攻毒保护试验和监测免疫反应相结合的方法，首次评估了Gorgan 株疫苗的免疫效果，包括其安全性、免疫源性和效力[31]。给牛接种1 mL Gorgan 株疫苗时（病毒滴度为3.5 或4.5 TCID50/mL），该疫苗对LSDV强毒提供了良好保护，在接种疫苗的动物中没有检测到不良反应。用迟发型超敏反应（DTH）检测，发现接种Gorgan 株疫苗的牛在接种部位显示出强烈的细胞免疫反应，表明具有高水平的免疫原性。另外，印度和孟加拉国使用山羊痘疫苗似乎也起到了满意的结果[13]。

虽然羊痘病毒属的3 种病毒具有较高的遗传相似性，但从最近的研究和疫情暴发中获得的数据及经验表明，弱毒绵羊痘疫苗对LSDV 野毒株只提供部分交叉保护[32-33]。许多国家使用绵羊痘疫苗防控LSD。例如：土耳其、格鲁吉亚和阿塞拜疆使用土耳其Bakirköy SPPV 株疫苗为牛接种，剂量为用于绵羊剂量的3～10 倍；俄罗斯联邦和亚美尼亚选择了由俄罗斯联邦动物卫生中心（ARRIAH）生产的绵羊痘冻干疫苗[34]；在以色列和约旦，使用了RM65 株弱毒疫苗[18，35]，其剂量是接种绵羊剂量的10 倍；在埃及和沙特阿拉伯，使用罗马尼亚SPPV 株[36]，其中沙特阿拉伯每6 个月给牛接种1 次疫苗，接种剂量是羊的10 倍[37]。与巴尔干地区使用同源疫苗成功控制LSD 相比，使用SPPV疫苗控制LSD不完全有效[27]。比如，2006—2007年，以色列使用南斯拉夫RM65 绵羊痘疫苗时，观察到了该疫苗效力较低，而Neethling 疫苗的临床效力是RM65 疫苗的4 倍[38]。目前，LSD 被认为是土耳其的地方病，也在俄罗斯部分地区流行，造成这一局面的原因除了这些国家对LSD 控制措施以及这些国家存在相对较大的牛种群等因素以外，使用SPPV 疫苗预防LSD 可能是其中重要原因[13]。

4 疫苗副作用

尽管弱毒同源疫苗通过连续传代致弱，但在使用Neethling 疫苗时，牛首次免疫时会产生副作用。常见的副作用包括接种部位的局部反应、短暂的发烧和产奶量下降[39]。有些动物可能会表现出温和的全身性反应，称为Neethling 反应。这些副反应不同于毒力较强野毒株引起的损害，通常只涉及浅表和较小的皮肤损害，在2～3 周内即可消失，不会转化为坏死性结痂或溃疡。在巴尔干地区使用LSD 疫苗获得的经验表明，同源疫苗只有第一次接种时才会出现副作用，再次接种几乎没有副作用。以色列一项测试弱毒同源LSD 活疫苗副作用程度的观察性对照研究结果表明，牛奶产量减少主要在接种疫苗后7 d 内，每头奶牛1 周内减少6～8 kg（取决于胎次）。在接种疫苗后的30 d 里，总体产奶量减少并不明显[40]。

为了防止LSD 传入，作为无疫国家的克罗地亚在2016 年8—11 月使用Neethling 疫苗开展了预防性接种。这是在没有野毒干扰的情况下，探索Neethling 疫苗接种后潜在不良影响的最佳案例。通过农场报告并得到兽医确认的被动监测，记录了接种后的不良反应：共有28 686 个牛场的431 367头牛免疫了疫苗，其中0.19%的农场（44 个）报道了0.09%的牛（399 头）与免疫相关联的不良反应和0.024%的牛死亡（102 头）；大多数不良反应发生在接种疫苗后2 周内；农场报告的主要不良反应为产奶下降（27%）、发热（22%）、注射部位水肿（21%）。其中某些症状（如产奶减少、发烧）可能由多种因素造成，因此不能排除其他病因，这也许高估了疫苗接种的不良反应程度[40]。

KSGP 疫苗的传代次数较低，其减毒水平比Neethling 株疫苗低。KSGP O-240 疫苗在某些品种的牛身上免疫后观察到了不良反应，奶牛临床症状类似于LSDV 自然感染，导致产生发烧、皮肤损伤和产奶量减少等临床症状[14，32]。

山羊痘疫苗和绵羊痘疫苗的副作用报道相对较少。绵羊痘疫苗在非感染或免疫牛身上引起的副作用比LSD 减毒疫苗引起的副作用更少，但是当大剂量接种SPPV RM65 疫苗可能会产生典型的疫苗副作用，如牛全身性皮肤损伤[41]。

5 疫苗质量控制

世界动物卫生组织在《陆生动物疫苗与诊断手册》中要求LSD 疫苗对所有品种、年龄和怀孕牛均须安全。这意味着：疫苗没有传染性，体外细胞传代后仍为弱毒；在使用推荐的免疫方式时，对所有品种的牛产生最小的临床反应；无外源病原污染，如病毒、支原体、细菌和真菌等；若疫苗用原代细胞培养必须排除蓝舌病病毒、口蹄疫病毒和狂犬病病毒等[13，42]。

疫苗质量控制中至关重要的一个环节是使用分子生物学手段定期检测疫苗中是否含有正确的羊痘病毒基因和毒株，检查疫苗中的病毒亚群[13]。在非洲的中部和北部以及中东等地区，由于绵羊痘、山羊痘和LSD 流行相互重叠，许多国家倾向于使用Neethling 疫苗免疫牛，使用KS1 疫苗免疫羊，因此一些LSD 流行国家的疫苗生产企业会提供两种类型的弱毒活疫苗。在同一生产线上生产两种疫苗可能会造成两种疫苗病毒交叉污染的风险[13]。

2017—2019 年以来，哈萨克斯坦、俄罗斯、印度、中国、越南和泰国等国家相继发现了类疫苗重组毒株，其来源一直是个谜。根据最新的研究[43]推测，这些毒株很可能是由于哈萨克斯坦接种了质控不合格的Lumpivax 疫苗后而产生的溢出结果。2016 年哈萨克斯坦暴发LSD 后使用了肯尼亚生产的基于Neethling 毒株的Lumpivax 疫苗（KEVEVAPI 公司，肯尼亚）。通过对两个批次的Lumpivax 疫苗进行全基因组分析发现，该疫苗似乎是多种羊痘病毒的复合物。利用迭代富集/组装策略，在疫苗中得到了类Neethling 毒株LSDV疫苗、类KSGP 毒株LSDV 疫苗和类GTPV 苏丹株的完整基因组，并且还存在几种重组毒株，而这些重组毒株与最近流行的类疫苗重组毒株几乎相同。这类疫苗重组株可分为4 组，重组毒株的巨大差异表明它们是在疫苗种子生产过程中产生。因此，推测近年来多个国家流行的类疫苗重组毒株极有可能是疫苗生产过程中污染了其他CaPVs 而产生的重组病毒。

6 结语

2019 年LSD 传入我国后，2 年内散播至十多个省份。此前国内对LSD 研究较少，对LSD 的防控可参考国际先进经验。欧洲巴尔干地区在短短几年内就成功控制LSD 的经验表明，如果区域内积极开展疫苗研发、大规模的群体免疫接种、相关动物贸易的移动限制、实施扑杀政策、消毒和虫媒控制等必要的防控措施，就可以有效控制LSD。因此，应结合国内的环境状况，积极开展疫苗、流行病学、监测诊断等相关防控技术研究，采取综合防控措施加快控制消灭LSD。