eDNA 技术在水生动物疫病监测中的适用性

段宏安，徐 晔，王凤芝，周 毅，丁 超

（连云港海关，国家水生动物检测重点实验室，江苏连云港 222042）

近年来，环境DNA（environmental DNA，eDNA）技术在水生生态、生物多样性和环境生物监测中的应用日益广泛[1-7]。该技术可以在各种环境中检测出目标生物的遗传痕迹[8-11]。结合不同的采样和DNA 提取方法[12]，eDNA 技术可用于检测和监测入侵物种[13]。eDNA 方法在检测和研究寄生虫[14]和水生动物病原体[15]方面的应用已有一些报道。eDNA 可以替代组织样本用于检测，从而可能在对高价值或稀有动物的监测中发挥重要作用。此外，eDNA 技术在野生种群疫病入侵或无症状感染动物的早期检测中具有一定作用。世界动物卫生组织（WOAH）水生动物委员会（Aquatic Animal Commission，AAC）逐渐意识到，eDNA 方法被应用于检测WOAH 名录中某些疫病的病原体时，由于在设计使用eDNA 技术的监测方案时无法获得诊断性能的准确评估，所以利用eDNA 方法获得的数据不太可能适用于支持对WOAH 名录中疫病的无疫声明。使用eDNA 方法也不能确认是否感染了WOAH 名录中疫病病原，因为阳性结果并不能证明易感动物受到了感染。然而，阳性的eDNA结果可以提供可能被感染的证据。AAC 于2021 年2 月组织会议制定了讨论性文件[16]供各成员评议。该文件总结了eDNA 技术在水生动物疫病诊断或监测方面的优势和局限性，拟就适当的应用提供指导。考虑到AAC 可能将eDNA 方法纳入WOAH水生动物疫病诊断手册相关疫病章节中的诊断方法，作为国际贸易中指定的诊断标准推荐给各成员使用，而我国目前在eDNA 方法应用于水生动物疫病监测方面的研究起步较晚。为此，本文结合AAC 讨论性文件，对eDNA 技术在水生动物疫病监测中的研究现状、优缺点、适用性和应用前景进行概述，以期为后续开展相关监测和研究工作提供参考。

1 eDNA 定义

eDNA 概念问世于1987 年，它涉及一种从沉积物中提取微生物DNA 的方法[10]。然而这个术语真正出现是在2000 年初，由微生物学家提出，是指无需首先分离任何目标生物体，而从环境样本（如土壤、水、空气等）中提取的DNA。它是由许多不同生物体的基因组DNA 和其可能降解成的小片段组成的复杂混合物。总的eDNA 包含源自活细胞或生物体的细胞内DNA，以及细胞自然死亡后结构破坏所产生的细胞外DNA。AAC 在其文件中将eDNA 定义为“从‘真正的’环境样本（如水、土壤、沉积物、生物膜）中提取的核酸”。而直接来自宿主的材料，如粪便、脱落的细胞和黏液，不包括在此定义中。从环境样本中提取的eDNA 可以用各种分子方法进行检测[17]。此外，eDNA 可以作为模板直接进行测序或在PCR 扩增目标基因后进行测序[14]。

2 应用研究现状

水生动物疫病呈现多发新发态势[18]。有些疫病在无症状时难以检出病原，某些物种因货值高或本身数量少，取样数量达不到健康监测要求也难以检出病原。目前WOAH 动物疫病名录中水生动物疫病有29 种，我国进境动物检疫疫病名录中的水生动物疫病有43 种，并且这2 个名录还在不断调整更新。新发疫病，如鲑甲病毒（salmonid alphavirus，SAV）、鲤浮肿病毒（carp edema virus，CEV），罗非鱼湖病毒（tilapia lake virus，TiLV）、十足目虹彩病毒1 型（decapod iridescent virus 1，DIV1）等病毒感染危害严重。病毒性疫病是制约水产养殖业发展的主要因素。病毒通过水传播是水产养殖场之间病毒传播的重要途径之一。Oidtmann 等[19]对9 种重要病毒在水生环境中的存活能力进行了研究，这些病原体包括6 种鱼病毒和3 种虾病毒。研究发现水生动物病毒（aquatic animal viruses，AAVs）有一些共同的趋势：（1）存活率随着温度的升高而下降（当在温度0 ℃以上时）；（2）水中的生物负荷越高，可检测到的病毒越少；（3）水中的病毒载量是一个时间函数。大多数AAVs 可以在水生环境中保持活力数天或数周，这取决于生理化学因素和水中微生物群。总之，AAVs 可以在水体环境中存活的特性，为利用eDNA技术检测和监测这些病原体提供了前提条件。

除了直接采集水生动物样本进行疫病监测和研究外，国外在应用eDNA 方法进行水生动物疫病监测方面进行了尝试。已有一些国外文献报道应用eDNA 技术检测WOAH 疫病名录中两栖动物、甲壳动物、鱼类和软体动物病原体。AAC 文件[16]中列出了33 篇关于使用eDNA 技术检测13种WOAH 水生动物疫病名录中病原体的文献，大多涉及野生水生动物种群中所列病原体的检测，特别是变形丝囊霉菌（Aphanomyces astaci）、箭毒蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）、蝾螈壶菌（B.salamandrivorans）、蛙病毒（Ranavirus）以及鲑三代虫（G.salaris）；另外还有13 篇针对其他特定病原体（如马可尼闭合孢子虫（Microcytos mackini）、病原体群，或将eDNA 方法应用于更广泛的研究领域（如病毒的水传播）。

2.1 eDNA 样本的收集和处理

土壤、沉积物、生物膜和少量水中eDNA 样本的收集和处理相当简单，可直接送到有资质的生物公司或实验室进行核酸提取、PCR 检测及测序。对大体积的海淡水样品，要使用eDNA 方法进行疫病检测，首先要考虑对水样中eDNA 的富集。除两栖类外，鱼虾贝类生存环境为水，国际国内贸易大多还是以水为介质运输的。水样的采集和其中DNA 富集是eDNA 检测和研究要考虑的重点。目前有多种技术对静水和流水进行水样采集，eDNA样品的处理可以基于两种不同的方案，即沉淀和过滤[20]。沉淀法适用少量水样，通常不超过15 mL[8，21]。在小型和/或湖泊水体中，目标生物种群密度高，沉淀法可以获得较高的检测成功率。过滤程序大多应用于大型和/或大量水体[22-23]。

在eDNA 研究领域，有不同类型的过滤器可供选择，包括玻璃纤维过滤器[23-25]、尼龙过滤器[26]、硝酸纤维素过滤器[22]、聚碳酸酯过滤器[27]或SterivexTM-GP 过滤器[25，28]。滤器类型的选择主要取决于所关注的eDNA 颗粒大小，过滤能力通常在15 mL 到10 L 之间，还要取决于过滤介质的特性，如孔径大小和亲水性，因每种类型的过滤器在样品处理过程中的处理方式是不同的。此外，水浊度是一个主要问题，会导致过滤介质的快速堵塞，孔径越小，这个问题就越严重。处理大体积的水样有利于检测稀有和新近入侵的物种，这些物种在自然界中的密度很低。为了浓缩大体积水样中的微生物，有不同的过滤方法可供选择，包括深度过滤（depth filtration，DF）和死端超滤（dead-end ultrafiltration，DEUF）[24]。

DF 方法是基于水在多孔和高压兼容的多层深度过滤器上的过滤，在过滤介质的表面和内部保留许多不同大小的颗粒。对于eDNA 研究，使用玻璃纤维过滤器可以满足最佳条件，孔径为0.7～2.7 μm，以便从水样中回收各种大小的颗粒。DEUF 方法使用超滤器，通常用于处理高达100 L的大水体，以浓缩和回收细菌和其他微生物[29-31]。Wittwer 等[32]应用DF 和DEUF，在德国的3 个河流系统中用qPCR 检测水体中的变形丝囊霉菌（A.astaci）孢子。两种eDNA 过滤方法都能成功地从3 个水系中回收和检测A.astaci 孢子，水浊度影响了两种eDNA 方法对A.astaci孢子的检测，其中DEUF 方法的颗粒重量增加，而DF 样品的水容量减少。尽管用DEUF 方法过滤高容量水样对A.astaci的检测率略高，而且似乎对A.astaci的检测更敏感；但其应用非常费力且成本较高。而DF方法快速、成本低、易操作，可获得非常可靠的定量结果，建议使用DF 方法来进行大规模筛查流水中的A.astaci。

带正/负电荷的滤膜也可用于海水样品中SAV[33-35]、传染性鲑贫血病毒（infectious salmon anaemia virus，ISAV）[36-37]eDNA 的浓缩。为了浓缩水样中的SAV，分别对3 个水箱中的1 L 水样通过正电或负电的膜过滤器过滤，过滤器插入1 个47 mm 的在线过滤器支架（merck millipore）。该支架安装在便携式环境采样泵上，然后用不同的缓冲溶液洗脱过滤器中的吸附物质，用试剂盒提取DNA，用PCR 或定量PCR 进行检测。另有报道[38]将采集的500 mL 水样通过装有ym30 再生纤维素膜的Amicon 超滤装置（Millipore Ltd）浓缩到大约2 mL，将2 mL 分成3 个等份，用于病毒分离、常规RT-PCR 和qPCR 的测试。同理，用带阳离子（Al3+）的过滤器及超滤方法[39-40]过滤浓缩500 mL 的水样中的DNA，用于检测锦鲤疱疹病毒（koi herpesvirus，KHV）。

上述方法过滤后，取出滤膜，用洗脱或试剂盒方法提取RNA 或DNA，用普通PCR 或定量PCR 检测病原。

2.2 eDNA 方法的验证、确认与诊断准确性

eDNA 方法已被广泛用于检测稀有物种的存在和相对丰度，特别是入侵或濒危水生物种，eDNA技术的快速发展已经涉及生物安全、环境保护等政策及管理措施的制定和实施，根据eDNA 监测结果做出动物疫病管理决策的可能性越来越大。因此，eDNA 监测产生的数据必须是准确可靠、可验证并以高质量标准执行。Klymus 等[41]利用多个合作实验室的数据集离散阈值法和曲线拟合建模法来确定eDNA qPCR 的检测限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），目的是对确定、解释和报告eDNA 检测方法LOD 和LOQ进行标准化，进行更有意义的实验室间验证，对不同eDNA qPCR 检测方法的质量和性能进行更合适的评估。还有一些报道涉及eDNA 方法的设计和报告注意事项[42-43]，其中许多研究阐明了检测大型生物体而非病原体的注意事项。

已有研究利用水生动物源性样品判定疫病检测方法的诊断准确性，相关文献提出了设计和报告标准。Laurin 等[44]针对2017 年WOAH《水生动物疫病诊断手册》（简称WOAH 手册）中列出的26 种水生动物疫病，对已发表的诊断试验准确性研究中的设计信息进行了评估，列出了在设计阶段需要考虑的重要指标，包括研究目的、目标疫病状态、适当样本的选择和标本、实验室分析方法、统计方法和数据解释，给出了设计标准建议，包括风险点和在每个关键步骤中减少偏差的措施。许多设计和报告的考虑因素也适用于eDNA 方法，建议将这些标准应用于eDNA 诊断准确性研究。

检验方法确认是确定方法适用性的过程。WOAH 手册第1.1.2 章介绍了传染病诊断试验的确认原则、方法和途径。确认的途径包括4 个阶段：第1 阶段是诊断试验的分析特征，包括备选方法与标准测试方法的比较，诊断试验的分析特异性和敏感性，重复性和初步重现性；第2 阶段是试验的诊断特征，选用参照动物或实验动物样本对诊断特异性、敏感性和阈值进行确定，实现临时认可；第3阶段是重现性，选择合作实验室，确定评估体系，对方法的重现，至此可命名为经确认为符合原始预期用途的试验方法；第4 阶段是实施，经WOAH国际认可，用选定的参考标准，解释试验结果，应用到其他实验室。为降低误差得到更高的置信度，必须扩大取样数量。对动物群体来说，这点容易实现。如果将eDNA 方法作为水生动物疫病的诊断方法，对其诊断性能的评估比较困难，对取样方案的设计包括取样地点、数量、取样的代表性等，都是必须认真考虑的因素。

3 在水生动物疫病监测方面的适用性

3.1 对判定临床健康和临床感染动物可疑病例及确诊病例的适用性

WOAH《水生动物疫病诊断手册》各特定疫病章节给出了诊断方法，对临床健康（或健康状况不明）和临床感染动物可疑病例和确诊病例进行定义。如果与受感染的种群有流行病学联系，例如在地理上接近已知感染种群，或从已知感染种群中移出水生动物水生动物产品或设备等，临床健康的种群可能属于怀疑对象，因此要进行采样。另外，需对临床健康种群进行采样监测，以证明无疫。eDNA 检测方法的结果是否适合作为《水生动物疫病诊断手册》特定疫病章节中病例定义的判定标准，分情况简述如下，并待进一步研究。

3.1.1 判定临床健康动物群体中可疑病例和确诊病例 从《水生动物疫病诊断手册》推荐的eDNA方法中获得的阳性结果可作为疑似病例的一项判定标准，但不适合作为确认临床健康动物病例的证据。利用动物来源样本的方法更适合作为确认临床健康动物病例的标准。确认临床健康动物病例的证据必须符合《水生动物疫病诊断手册》相关疫病章节临床健康动物中确诊病例的要求，eDNA 方法不适合作为判定标准。

3.1.2 判定临床患病动物疑似病例和确诊病例一般不建议在临床患病动物群体中抽取环境样品调查病因，因为临床患病动物的样品更有可能检出病原体，更适合于疫病调查。然而，在某些情况下，eDNA 方法可能会检测出病原体，并可能发现以前没有观察到的疫病临床症状。在这些情况下，从《水生动物疫病诊断手册》中推荐的eDNA 方法获得的阳性结果被认为提供了充分的证据，可作为疑似病例的判定标准。任何阳性的eDNA 测试都需要进一步调查，包括采集和测试动物组织，按照《水生动物疫病诊断手册》中有关疫病的具体章节操作，证实临床患病动物病例的证据必须符合《水生动物疫病诊断手册》相关疫病章节临床患病确诊病例的要求，eDNA证据不能作为确诊病例的一项判定标准。

3.2 在水生动物疫病监测中的优势

AAC 文件[16]认为，eDNA 检测是一种很有前途的工具，可以作为对水生动物进行直接采样监测的补充。与直接采样检测相比，eDNA 方法有一些优越性：不需要对水生动物进行破坏性采样，这可能对稀有或珍贵的水生动物，或难以收集的野生动物至关重要[45]；eDNA 方法不需要处理动物，避免了与获得损伤性组织样本有关的应激[46]；与采集和处理单个动物样品相比，样品收集和样品处理时间及成本可能会大大降低；由于环境样品可能包含来自整个或大部分目标捕捞群体的eDNA，即使eDNA 方法的诊断灵敏度较低，也可能只需要更少的样品来检测病原体（与单个动物样品相比）；同一环境样本可以分析是否存在易感宿主和多种病原体。

3.3 在水生动物疫病监测中的局限性

基于eDNA 的病原体检测应用存在一定的局限性，AAC 文件总结了以下几点：（1）由于环境稀释和核酸的降解，环境样品中的目标DNA 可能非常少，这可能对该方法的灵敏度产生负面影响；（2）环境样品中的目标DNA 浓度会因一系列因素而变化，如宿主密度、感染的流行率和强度、采样方法（如采样量、过滤器孔径、储存条件）和环境条件（如有机物数量），因此eDNA 方法的敏感性在不同地区、不同时间和目标种群之间的差异可能比直接取样测试动物组织的差异更大；（3）还没有正式的框架来评估使用eDNA 方法测试的诊断性能，这意味着使用eDNA 方法证明无疫病是不合适的；（4）与动物来源的样本相比，在环境样本中检测到目标病原体DNA 阳性，可能是污染源造成的，同样它也可能不表明宿主动物感染了目标病原体。

4 应用前景

按照WOAH 《水生动物卫生法典》的要求，声明无某特定疫病的国家或地区必须有疫病早期监测系统，养殖（场）户报告发病和死亡是早期监测系统的重要组成部分。养殖种群只有在流行病学上与野生种群有联系时（如共享水源）才能作为后者的哨兵动物，否则就需要对野生种群进行主动监测，因为野生动物发病或死亡不易被发现并报告，特别是由于死亡或濒临死亡的野生动物可能会被迅速清除或捕食。野生种群的动物采样可能会很困难，特别是当种群偏远、分散或数量较少使得破坏性采样不可取时，而基于eDNA 的病原体检测方法克服了野生水生动物采样遇到的许多问题。

在某些条件下或在某些宿主物种中，一些病原体感染，不会一成不变地引起可观测到的临床症状。在这种情况下，依靠养殖（场）户（或其他人）观察发病或死亡的早期监测系统是无效的，需要主动监测。经常对养殖动物进行采样，并达到检测低流行率的水平，成本较高。eDNA 方法提供了一种可行的替代方法，用于主动监测那些很难引起可观测临床症状的病原体。它还有一个优势，即样本将包含来自很大比例捕捞群体的目标分析物。因此，与动物样本相比，需要的环境样本相对较少，只要能提取足够的DNA 即可。

养殖场可以在生产周期结束或疫病控制计划完成后，例行地进行休渔。在休渔期进行eDNA检测可以对何时重新放养提供支持。因此，eDNA提供了一个比放养哨兵动物更经济和实用的选择，以保证清除了病原体。

eDNA 的主要局限性是缺乏验证和诊断性能数据，这意味着阴性结果不能用来证明无疫病，阳性结果总是需要用动物样本来确认。然而，在以上所述3 种情况下，环境采样比动物采样更有优势，提示eDNA 方法可以被有效整合到监测计划中。

随着水产养殖业发展、养殖技术进步和人民生活水平提高，我国进口食用、种用和观赏用水生动物种类和数量呈现上升趋势，如食用类帝王蟹、龙虾、象牙蚌，海淡水观赏鱼，进出境种鱼种虾等，这些价格高、数量少，按照健康监测要求进行致死性取样比较困难或不现实的物种，会因采样数量达不到比例导致疫病难以被检出。采用eDNA 方法对进境食用水生动物、种用和观赏水生动物的运输用水、运输工具或包装内水生动物主要病原进行分子生物学检测，不需要对水生动物进行破坏性采样，不需要处理动物，避免应激，可能更适用于稀有或珍贵的水生动物，或难以收集的野生动物。与采集和处理单个动物样品相比：eDNA 样品收集和样品处理时间及成本可能会大大降低，同一环境样本可被分析是否存在多种病原体，以达到检测水生动物疫病的目的；既能了解判断进境水生动物疫病状况，防范进境动物输入疫病的风险，又能不抽取减损任何动物个体，特别是少量、珍贵、特种、高货值水生动物；既把守了国门生物安全，又便利了水生动物引进，满足大众生活需要，达到双赢；还可尝试用于出境食用、种用和观赏用水生动物养殖场、隔离暂养场等水生动物疫病监测，特别是珍贵、特种高货值水生动物及大型水面（如江、湖、河、海水养殖）水生动物疫病的监测。