代谢组学在药用植物非生物胁迫中的应用

原静静，孙晓琛，栗锦鹏，陈彦宏，张博洋，王惠珍

1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.西北中藏药协同创新中心，甘肃 兰州730000

代谢物是细胞调节过程的最终产物，其水平可被视为生物系统对遗传或环境变化的最终反应。生物系统合成的一组代谢物构成其“代谢组”，主要是指细胞中所有低分子量代谢物（M<1 000）的集合，这些分子属一般代谢反应的参与者，是细胞维持生长和正常功能所必需[1]。代谢组学是以高通量、高灵敏度、高分辨率等现代仪器分析为手段，结合生物统计数据处理及模式识别等化学计量学方法，目标是分析生物体（细胞、组织或器官）受刺激或扰动（如药物、基因改变或环境变化）后代谢组的变化，并探索其代谢网络的技术。继基因组学、转录组学、蛋白质组学后发展起来的代谢组学，可提供特定环境条件下植物表型的明确信息，上游基因、蛋白质层面的变化能在下游诸多代谢产物中得到放大，并使这些变化更易被观察到，因此能更好地解释生物系统与其环境之间的相互作用及所有相关扰动[2]，且实验成本较蛋白质组学和转录组学低2～3倍[1]。

自然界普遍存在非生物胁迫因素，已成为制约植物生长发育、影响植物产量和质量的关键因素。代谢组学的兴起为研究植物非生物胁迫下的代谢途径变化和耐受机理提供可靠手段，已在小麦[3]、番茄[4]、玉米[5]、水稻[6]及大豆[7]等作物中得到广泛应用，并在一些药用植物相关研究中逐步展开。笔者结合相关文献，梳理代谢组学在药用植物非生物胁迫研究中进展，为更深入探寻药用植物非生物胁迫耐受性相关的代谢网络提供参考。

1 分析技术

代谢组学能更好地了解代谢网络及植物和其他生物有机体的后续生化组成，代表了生物系统中所有代谢物的无偏见识别和定量，因此分析技术的选择性和灵敏度要求很高[8]。核磁共振技术（NMR）由于灵敏度和信号分辨率低，通常仅限于代谢指纹图谱。鉴于植物代谢组中预期的物质（如植物激素、氨基酸、低聚糖等）物理化学性质，液相色谱-质谱（LC-MS）是植物代谢组学中最常用的技术[9-12]。毛细管电泳与质谱联用（CE-MS）是分离植物高极性、带电荷的低分子量代谢物（如辅酶、胺、嘌呤碱及核苷酸等）的方法[10-11]，但在植物代谢组学中很少应用。相较LC-MS，气相色谱-质谱联用（GC-MS）提供了更好的重现性和更多结构信息[10]，但在分析非挥发性代谢物之前需进行衍生化步骤[9，11]。因此，GC-MS 被用于测定低丰度、半挥发性植物激素或衍生化（通常是甲氧基胺化后再进行甲硅烷基化）后的初级代谢物[9-10]。但无论何种分离技术，基于高分辨率质谱（HRMS）的技术都是植物代谢物分析的首选方法[13]。另外，HRMS探测器（如飞行时间、傅里叶变换-离子回旋共振和Orbitrap质谱仪）的高分辨率/高质量精度、精确的质量和同位素剖面测量允许推断未知化合物的明确分子式[14-15]。

2 在药用植物非生物胁迫中的应用

非生物胁迫主要包括盐胁迫、水分胁迫、温度胁迫及辐射胁迫等[16]。这些非生物胁迫均会导致药用植物体内生理生化特性改变并造成严重影响，如由不同盐水平引起的渗透胁迫和特定离子效应会导致水分不足、细胞毒性和生长迟缓[17]；干旱情况下土壤中水分利用率降低也会影响植物的生理和代谢活动[18-19]。当植物面临环境胁迫时，会产生多种初级和次级代谢物以保护自身免受伤害。初级代谢物普遍存在于植物体内并参与生长、发育或繁殖等重要过程，如蛋白质、脂质、可溶性糖等[20]。次生代谢物如萜类、黄酮、生物碱等并不直接参与上述作用，但在植物生命活动中起着重要作用，如机体防御、信号转导及抵御逆境等[21-22]。不管植物受何种胁迫，代谢组学有希望找到逆境下的潜在生物标志物。

2.1 水分胁迫

由于全球气候变暖而导致极端气候事件增多，干旱和洪涝频繁发生，对全球范围内的植物生长造成威胁。在水分胁迫研究中，Dai 等[23]利用NMR 和LCDAD-MS研究丹参Salvia miltiorrhizaBunge在干旱胁迫下的代谢组变化，分析出初级代谢产物29个，次级代谢产物44个，并首次检测到5种多酚类化合物、京尼平、伞形花内酯等；进一步分析发现，干旱促使丹参酮和脯氨酸的合成加强，碳和氨基酸代谢发生变化，但因日照而引起的干旱促进了莽草酸介导多酚类合成的代谢，而因空气干燥引起的干旱则抑制此途径。有报道，利用LC-MS 研究党参Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.在干旱胁迫下代谢组变化，与对照相比，轻度、中度和重度干旱胁迫分别鉴定出274、284和317个显著差异代谢物，差异代谢物被注释到京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库得到82条差异代谢通路，其中鞘脂类代谢为极显著富集的差异代谢通路（P<0.01），精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢、丙氨酸代谢、半乳糖代谢、烟酸及烟酰胺代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、花生四烯酸代谢、亚麻酸代谢和甘油脂类代谢为显著富集的差异代谢通路（P<0.05），对富集前后的差异代谢物进行分类发现，主要集中在脂肪酰基、羧酸类及其衍生物、有机氧化物三类[24]。刘洋[25]利用GC-MS 研究膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge 和蒙古黄芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus（Bunge）P.K.Hsiao在干旱胁迫下的代谢组变化，共鉴定约196种代谢物，包含糖、酸、醇及其他化合物等，分析得出蔗糖、果糖和苹果酸仅在蒙古黄芪叶片中作为显著差异代谢物出现，苹果酸和甘露糖仅在膜荚黄芪叶片中显著增加，仅蒙古黄芪出现明显增强的蔗糖和肌醇（参与渗透调节和能量代谢）积累；又利用UPLC-qTOF-MS分析28种酚类代谢物和2种关键化合物发现，在干旱进程中，异黄酮仅在2个黄芪品种的根中表现出显著增加，酚酸类物质仅在蒙古黄芪叶片中有显著增加，而膜荚黄芪黄酮醇类物质含量增加。Wei等[26]利用LC-MS研究红花Carthamus tinctoriusL.在干旱胁迫下的代谢组变化，在品种PI401477和PI560169中分别鉴定出359和209种差异代谢物，发现3种代谢物（半乳糖醇、新黄嘌呤和熊果苷）与这2个品种的耐旱性相关，并受不同调控。Ueno 等[27]利用GC-MS 研究薇金樱子Mikania laevigata和薇茅Mikania glomerata在水分不足情况下的变化，薇金樱子挥发物中大约一半的化合物增加，水分过量时与对照结果相似。增加的化合物包括：反式-2-己烯醛、α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、α-古巴烯和β-荜澄茄油烯。香豆素和大根香叶烯D在缺水条件下也增加，但与对照组无显著差异。对于薇茅，反式-2-己烯醛，α-蒎烯、β-蒎烯和柠檬烯在水分亏缺下增加。Ashrafi等[28]利用NMR研究百里香Thymus vulgaris和Thymus Kotschyanus在干旱胁迫下的代谢组变化发现，蔗糖、葡萄糖、丙氨酸、胆碱及丝氨酸均起到渗透保护作用，表明干旱胁迫显著影响糖、氨基酸和能量代谢，其中，三羧酸（TCA）循环中间产物是提供能量和碳骨架的最重要的循环，比糖和氨基酸代谢更易受干旱影响，因此，在诱导耐旱性方面可能具有更突出的作用。

2.2 盐胁迫

土壤盐碱化已成为限制植物生长的最具破坏性难题之一，对农业生产造成巨大威胁。蔡芷辰等[29]利用UFLC-Triple TOF-MS/MS 分析忍冬Lonicera japonicaThunb.在盐胁迫下的代谢组变化，经主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），金银花盐胁迫组与对照组样品得到明显区分，筛选并鉴定出31个差异成分，对其中酚酸类、黄酮类及环烯醚萜类等15个目标差异成分（药效成分）进行分析，呈现不同的变化规律；又利用UFLC-QTRAP-MS/MS对15个目标差异成分进行测定，初步表明适度的盐胁迫可促进金银花中药效成分的合成与积累。刘子修[30]利用UPLC-qTOF-MS 分析夏枯草Prunella vulgarisL.在盐胁迫下的代谢组变化，与对照组相比，50、100、150 mmol/L盐胁迫组分别筛选出146、175和159个差异表达代谢物，上调和下调表达的代谢物分别为48/97、76/99 和55/10，其中最显著的上下调代谢物分别是3,4-二甲氧基肉桂酸、肌酸、三甲胺N-氧化物/Tyr-Leu、脱氧核糖、2'-脱氧腺苷5'-单磷酸、去甲脒酮、DL-苯丙氨酸、赖氨酸-苯丙氨酸/顺-9-棕榈烯酸、肉豆蔻酸、别嘌呤醇核苷、吡哆胺、氧化三甲胺、N-α-乙酰-L-精氨酸/3,4-亚甲基二氧亚甲基苯丙胺、L-岩藻糖-1-磷酸和酮亮氨酸；进一步代谢物鉴定和代谢通路综合分析表明，在盐胁迫下，差异代谢物主要富集在丙氨酸、天冬氨酸谷氨酸代谢、苯丙氨酸代谢及嘌呤代谢等生物通路。Wang 等[31]利用LC-TOF-MS 分析蓖麻Ricinus communisL.在盐胁迫下的代谢组变化，PCA 结果表明，盐胁迫下子叶和根中的代谢产物差异很大，子叶有38种差异代谢物，主要包括脂肪酸、核酸和有机酸，而根中只有19种差异代谢物，主要包括脂肪酸和有机酸。此外，KEGG通路富集分析表明，黄酮和黄酮醇、泛酸和辅酶A、柠檬酸循环和类胡萝卜素生物合成是这2个器官在盐胁迫下的共同代谢途径。盐胁迫主要通过碳、氮代谢引起代谢过程改变，增加根向子叶的碳分配。此外，氨基酸和核酸谱的变化仅在子叶中发现，而根可以增强抗氧化酶系统清除活性氧的活性。

2.3 紫外线-B胁迫

吴可心[32]利用UPLC-MS分析刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms在紫外线-B（UV-B）胁迫下的代谢组变化，UV-B辐射后刺五加皂苷表现较强的组织特异性，主要表现在上位叶中；中度胁迫显著提升各位叶中齐墩果酸的含量，以及上、下位叶中异嗪皮啶和金丝桃苷的含量；重度胁迫下各位叶中异嗪皮啶和金丝桃苷含量均上升，但齐墩果酸含量下降。又利用UPLC-qTOF-MS测定叶片中14种酚类化合物，包括酚类化合物合成前体（L-苯丙氨酸）、4种C6C1型化合物（丁香酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、香草酸）、6种C6C3型化合物（对羟基肉桂酸、染料木素、咖啡酸、绿原酸、原儿茶酸、对香豆酸）、3种C6C3C6型化合物（槲皮素、山柰酚、芦丁）。UV-B辐射后上位叶中酚类化合物合成前体物质积累量升高，且随叶位递增；中度胁迫下，C6C1型化合物在各位叶的积累量均呈上升趋势。UV-B胁迫后，C6C3型化合物积累量整体呈下降趋势，而黄酮类（C6C3C6型）化合物积累量普遍升高，且山柰酚最为明显。

刘洋[25]利用GC-MS 研究膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge 和蒙古黄芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus（Bunge）P.K.Hsiao在UV-B胁迫下的代谢组变化，共鉴定出144种代谢物，包括2种黄芪根和叶组织中共79种差异显著的化合物。其中，蒙古黄芪叶组织中显著增加的化合物中有2种是糖类化合物，根组织有4种糖及2种糖苷化合物；相似的，在膜荚黄芪叶组织中显著增加的化合物中没有糖类，而根组织有5种糖类化合物。作为能量来源的糖，在地上组织中减少，而地下组织中增加。这意味着UV-B胁迫促使2种黄芪的生长能量均显示出向地下组织转移的趋势。又利用UPLC-qTOF-MS分析28种酚类代谢物和1种关键化合物。在UV-B辐射增强条件下，蒙古黄芪和膜荚黄芪的根和叶片中大部分C6C1碳骨架的酚类化合物都表现出减少趋势。不同的是，蒙古黄芪中C6C3碳骨架的酚类化合物在UV-B辐射胁迫下均有所减少，而C6C3C6碳骨架酚化合物大部分有所增加；与此相反，在膜荚黄芪中，C6C3碳骨架酚化合物在UV-B辐射胁迫下有所增加，而C6C3C6碳骨架酚化合物大部分有所减少。鉴于C6C3C6碳骨架化合物比C6C3碳骨架化合物更优秀的UV-B辐射吸收能力，蒙古黄芪这种以C6C3碳骨架化合物为代价的C6C3C6碳骨架化合物的增加，可能会带来更好的UV-B辐射防御能力。

杨丙贤[33]利用GC-MS 分析圆锥铁线莲Clematis ternifloraDC.在UV-B胁迫下的代谢组变化，共鉴定113个代谢物，其中62个差异响应了高强度UV-B辐射和黑暗胁迫；通过对代谢物的分析，推断圆锥铁线莲在胁迫下氨基酸代谢和有机酸代谢是增强的，而碳水化合物的代谢显著碱弱，表明叶片在胁迫逆境下，其光合作用和呼吸作用的减弱及次生代谢增强。又利用UPLC-MS/MS分析鉴定了160个代谢物，并利用NMR技术对其中7个代谢物进行结果确证，结果有38个次生代谢物含量发生显著变化，其中19个次生代谢物响应胁迫处理而被特异合成，这些代谢物主要属于脂肪酸类、内酯类、多酚类、苯甲酸类、香豆素类及芪类。而聚类分析显示，香豆素是显著变化的次生代谢物的主要成分。

2.4 其他胁迫

除上述胁迫外，植物还常受其他逆境的胁迫，如冷胁迫、冻融胁迫、多重胁迫等。Rastogi 等[34]利用GC-MS研究圣罗勒Ocimum tenuiflorum冷胁迫下代谢组变化发现，苯丙素类化合物（丁香酚和甲基丁香酚）含量均有下降；结合转录组数据分析表明，苯丙素类化合物合成途径相关基因PAL、C4H、4CL表达下调是导致丁香酚和甲基丁香酚含量降低的主要原因。Shi等[35]利用NMR 和LC-MS 研究决明Senna tora（Linnaeus）Roxburgh在冻融下的代谢组变化，并对108种代谢物进行相对定量分析。在第3个循环后，冻融诱导的影响程度较小。连续5次冻融循环后，水苏糖、蔗糖、去甲红霉素-6-O-β-d-吡喃葡萄糖苷、槲皮素3-(3''-乙酰半乳糖苷)含量降低，而苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、甘露糖、葡萄糖酸和缬氨酸含量升高。

管仁伟等[36]利用UPLC-QTOF-MS 研究黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi在干旱及盐胁迫下的代谢组变化，分析鉴定出44个黄酮类成分，差异代谢物共筛选出18个黄酮类成分；且主要黄酮类代谢产物相对定量值随干旱及盐胁迫程度增强呈现先升高后降低的变化趋势。由此得出干旱及盐胁迫会引起黄芩黄酮类成分含量和差异成分种类的改变，适度干旱胁迫可促进黄芩黄酮类成分的合成积累，但程度有限。

3 展望

代谢组学拓展了对植物耐受非生物胁迫分子机理的认识，能检测大部分胁迫响应的代谢物质，目前已有通过代谢组学找出差异代谢物，并通过外源施加方式作用于植物的逆境研究，如丙二酸浸泡小麦种子[37]，紫花苜蓿叶面喷施外源5氨基乙酰丙酸[38]可提高抗旱能力，长春花外源施加海藻糖[39]可促进拮抗低温胁迫，外源表没食子儿茶素没食子酸酯可缓解盐胁迫对番茄种子的抑制作用和缓解低温、高温和干旱等非生物胁迫对幼苗造成伤害[40]，外源褪黑素可缓解盐胁迫对棉花种子的抑制作用[41]等，这些生物标志物可提高植物逆境下的生存能力。而药用植物方面的研究多数仅限于差异代谢物的鉴定和筛选等，因此下一步可将筛选的功能代谢物通过外源加入方式进行验证，并通过生理生化特性、转录水平等变化解析外源代谢物的作用机理，以辅助培育耐旱、耐盐等药用植物品种。