产酯酵母在发酵食品中的应用研究进展

袁海珊，刘功良，白卫东，肖更生，梁景龙

（1.仲恺农业工程学院 轻工食品学院 广东省岭南特色食品科学与技术重点实验室，广东 广州 510225；2.仲恺农业工程学院 轻工食品学院 农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，广东 广州 510225）

我国的传统发酵食品历史悠久，种类繁多，因其独特的风味以及丰富的营养成分，逐渐成为人们生活中不可或缺的一类食品，也是食品产业中的重要组成部分。发酵食品是指经过所需的微生物发酵作用或生物酶转化作用而制成的食品[1]，微生物作为发酵过程中的主力军，不仅对发酵产品的成败起决定性的作用，而且微生物代谢作用还赋予了产品独特的色泽、质地、口感、风味、营养等，在一定程度上提升了产品的感官质量。

产酯酵母是一类能够代谢产生酯类物质的酵母菌，因其能合成具有芳香气味的酯类物质[2]，也被称为产香酵母。除此之外，产酯酵母能通过自身的代谢使发酵过程产生醇类、酯类、酚类、酮类等具有挥发性的风味物质。不同菌种产酯情况各异，在酒类、调味品、功能饮料等发酵食品当中的作用也有所差异，因此，选育合适的产酯酵母并合理应用，能有效改善发酵产品的风味。为此，本文将对发酵食品中产酯酵母的来源、产酯机理及应用进行全面地综述，以期为提升和改善产酯酵母在发酵食品风味中的研究提供参考。

1 产酯酵母的来源

产酯酵母多为野生酵母，是发酵食品中的重要产香菌株，具有较强的产酯能力，不同的产酯酵母产生的香气略有不同。目前，产酯酵母的来源丰富，可从酒曲、果酒、果汁、水果、泡菜、酱醅等食品原料中分离出来，如表1所示，在发酵食品的酿造过程中，它们是形成食品香气成分的重要菌群。

表1 产酯酵母的来源及其种类Table 1 Sources and species of ester-producing yeast

产酯酵母的培养条件与其他酵母菌并无明显差别，但其氧化特性和产酯能力较强，温度、pH等环境因素的变化也会影响产酯酵母的生长代谢。汉逊酵母（Hansenula）、球拟酵母（Torulopsis）和假丝酵母（Candida）是白酒生产中使用得最多的产酯酵母菌，旨在提高酒的主体香含量；而易变球拟酵母（Torulopsis versatilis）、埃契氏球拟酵母（Torulopsis etchellsii）和蒙奇球拟酵母（Torulopsis mogii）则是生产酱油中使用得最多的耐盐性产酯酵母菌，可提高酱油的酱香，它们的共同特点是能产生酯类等芳香物质，丰富产品的风味。

2 产酯酵母的产酯机理

酯类物质主要为产品提供果香与花香等芳香气味，与酸类和醇类物质相比，大部分酯类物质的气味阈值较低，但对风味的贡献较大，因此，了解产酯酵母的产酯机制，以便能够更好地控制其在产品中的含量以及促进产酯酵母在发酵食品中的应用。不同的产酯酵母产生的香气各不相同，不同的代谢途径产生的物质也各不相同。

酯类物质的合成有醇类（乙醇或高级醇）、脂肪酸、辅酶A和醇乙酰基转移酶（alcohol acyltransferase，AATase）等物质参与。主要途径有三种：一是微生物酶酯化反应途径。这一反应途径主要由发酵过程中微生物的代谢反应生成。醇和酸是合成酯类物质的重要底物，发酵过程中的乙醇主要是由酵母菌在厌氧条件下发酵产生，在乙醇生产过程中，氨基酸分解代谢途径与生物合成产生高级醇[15]。酸类物质主要由发酵过程中的微生物代谢生成，在脂肪酶、酯酶、角质酶等羧酸酯水解酶的作用下，酸类和醇类通过催化反应生成相应的酯[19]；二是醇乙酰基转移酶途径。研究表明，醇乙酰基转移酶是生物体内化学反应合成酯的关键酶[20]，该酶在乙酸酯类的生物催化合成中有着重要作用。醇乙酰基转移酶通过催化乙酰辅酶A与乙醇、异戊醇、异丁醇等醇类作用生成乙酸酯[21]；在酵母合成其他酯类物质的过程中，脂肪酸需与辅酶A先结合，形成相应的酰基辅酶A[22]，醇乙酰基转移酶再通过催化相应的酰基辅酶A与乙醇作用生成脂肪酸乙酯[23]；三是化学反应途径。在发酵后期以及储存过程中，醇类和酯类物质通过简单的有机化学反应合成相应的酯。

3 产酯酵母的应用

3.1 产酯酵母在白酒中的应用

我国的白酒香型主要有四种：分别是酱香型、浓香型、清香型以及米香型[24]。不同香型的白酒其主要的呈味物质也有所不同。白酒中的酯类物质主要是乙酯，占所有酯类的46.29%[25]。酱香型白酒主要的呈香物质是己酸乙酯和丁酸乙酯[26]；浓香型白酒主要的呈香物质是己酸乙酯[27]；清香型和米香型白酒中主要的呈香物质则是乙酸乙酯和乳酸乙酯[28]。可以看出，酯类物质是决定白酒风格与品质的关键化合物。为了增加白酒中的独特香气，在生产过程中会加入特定的添加剂，但酒体香气仍然单薄，口味较淡，但产酯酵母的加入使得酒体中的风味物质更加丰富，且口感更为独特。在白酒发酵过程中，产酯酵母以糖类、有机酸等为营养成分，在酯酶作用下合成酯类物质，促进白酒特征性风味物质的形成[29]，可在一定程度上改善白酒香气不足和口感不醇厚等问题。

酿酒酵母属（Saccharomyces）是主要产生酒精的一类酵母菌属；非酿酒酵母属主要包括毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）等，主要产生酯类等芳香化合物。其中，汉逊酵母是在白酒生产中应用最多的产酯酵母[30]。明红梅等[5]从浓香型大曲中分离出一株耐高温酵母菌株，经分子生物学鉴定J3为异常威克汉姆酵母（W.anomala），其产2-正戊基呋喃、苯乙醇等香气物质的含量较高，为大曲酒的香气带来重要贡献。夏玙等[31]从大曲中分离筛选出一株异常威克汉逊酵母（W.anomalus），将其用于麸曲制作并应用于清香型小曲白酒酿造中，可使乙酸乙酯和总酯含量显著提升，清香型白酒风格更为突出，口感更佳。

白酒的风格和质量受乙酸乙酯的影响很大，产酯酵母则在产乙酸乙酯方面超越了细菌和霉菌，利用产酯酵母提高白酒中乙酸乙酯的含量已成为许多学者的首要选择。董士伟等[32]在豉香型白酒发酵环境中分离得到一株优良产酯酵母，将其强化应用于豉香型白酒中，其产乙酸乙酯含量提高了49%，且酒体的香气更为突出。刘小改等[33]将一株高产乙酸乙酯的产酯酵母J-4用于清香型麸曲白酒酿造，其产乙酸乙酯含量高达1.07 g/L，总酯含量比空白组提高了50.7%，改善了原酒的口感，提升了原酒的品质。FAN G S等[34]研究了异常威克汉姆酵母（W.anomalus）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共同作用对乙酸乙酯产量的影响，发现两种酵母之间的使用配比为3∶1时，产生的乙酸乙酯高达6.41 g/L。两种酵母的协同发酵不仅提高了乙酸乙酯的产量，而且增加了其他风味化合物的含量，如β-苯乙醇和苯乙酸乙酯等。

拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）是各种发酵食品中常见的产酯酵母，其广泛存在于酒、茶、醋等中[35-36]。XU Y等[37]研究了Z.bailii在酱香型白酒发酵液中的发酵特性，结果显示，它能产生包括醇、酸、酯、醛和酮在内的多种风味化合物。此外，与30 ℃相比，在37 ℃时（白酒发酵的最高温度），酸和醛的产量分别增加了110%和41%，有利于提升白酒的香气和品质。李海营[38]从窖泥、酒曲以及酒糟中分离得到5株酵母菌，经鉴定其中一株为拜耳接合酵母（Z.bailii），将其用于酵母液体曲的制备，进行液体白酒发酵，结果表明，总酯含量以及乙酸乙酯含量都有所提升，白酒香气清正，入口绵甜，达到国家清香型白酒优级标准。

3.2 产酯酵母在果酒中的应用

果酒是通过压榨新鲜水果取其汁液，经过发酵而成的低酒精度发酵酒。因其能保留水果中部分营养物质，越来越受到群众的喜爱，果酒行业由此不断进入深发展。葡萄酒是世界上被消费最多的一种果酒。随着消费者需求的日益多样化，市场上的果酒种类也越来越丰富[39]。目前市场上已有的果酒包括荔枝酒、苹果酒、梅子酒、蓝莓酒等[40-43]。水果表皮上的野生酵母能利用水果本身的糖分产生酒精，生成果酒。而酵母菌株在果酒香气和风味的形成上起着重要作用[44]，虽然果皮表面上的野生酵母能用于酒精发酵，但容易受到污染或者生产出来的果酒风味不佳。为了提高果酒的产量以及缩短发酵周期，目前果酒的酿造大多采用单一菌种发酵，如酿酒酵母（S.cerevisiae），虽然酿酒酵母有较强的产酒精能力，但产香能力不足。

近年有研究表明，非酿酒酵母的加入在果酒生产中可起到增加香气、丰富口感的作用[45]。在发酵初期，非酿酒酵母菌的生长会产生一些影响果酒香气的重要成分，使果酒的口感和香气更为复杂。果香和花香是果酒散发出的特有清香，有报道显示，这与发酵过程中产生的乙酸酯密切相关[46]。酯类物质是构成酒体香气的主要成分，在果酒发酵过程中，产酯酵母能分泌葡萄糖苷酶、果胶酶、蛋白酶等酶类，在代谢过程中产生许多酯类、醇类、酸类等香气化合物，可有效提升果酒的风味，使酒体更为浓郁协调。因此，产酯酵母也常常被用于与酿酒酵母一同混合发酵，成为果酒添加菌种中最受欢迎的菌种之一。

叶萌祺等[47]从苹果库空气样以及苹果样品中分离纯化得到6株产酯酵母菌，经鉴定菌株YN6为异常威克汉姆酵母（W.anomalus），将其与苹果酒酵母WLS21混合发酵，与对照菌株WLS21独立发酵结果相比，酒体中挥发性香气成分的种类（包括丙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸-2-甲基丙基酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯和壬醛）和含量均显著提高，主要挥发性香气物质的质量浓度提高了约2倍。张阳等[48]将葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）与酿酒酵母进行混合苹果酒发酵，与酿酒酵母单一发酵相比，混合发酵苹果酒中香气物质种类明显增多，乙酸酯类和萜烯类等物质含量也先显著提高，且脂肪酸类物质含量显著降低，丰富了苹果酒的香气，酒体果香清雅、浓郁舒适。LU Y U等[49]研究戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）和耐热克鲁维酵母（Kluyveromyces thermotolerans）对榴莲酒发酵的影响，发现这两株菌发酵的榴莲酒中存在更多的高级醇和乙酯，酒体风味更醇厚，口感更为丰富。BINATI R L等[50]研究了混合接种对葡萄酒品质的影响，通过同时接种和顺序接种本地非酿酒酵母，与单独接种酿酒酵母相比，梅奇氏酵母（Metschnikowiaspp.）能有效促进高级醇和酯类物质的产生，并且能减少挥发性苯酚，对葡萄酒的香气和成分有积极影响。陈清婵等[51]从橘子果实上分离筛选出一株优良产香酵母菌株JZ-3，该菌株酿造出来的橘子酒酒体丰满醇厚，气相色谱分析结果显示含香气物质22种，保留了橘子的清新淡雅，整体酒香协调、口感纯正。

3.3 产酯酵母在黄酒中的应用

黄酒因其独特的香气、微妙的风味和较低的酒精含量，在中国东南部地区广受欢迎[52]。经过长达数千年的发展，产生了许多具有地域代表性的黄酒，如绍兴黄酒、山东兰陵酒、金华酒、代州黄酒、河南双黄酒等。黄酒是一种复杂的混合物，除了乙醇外，还存在多种化合物，且风味化合物来源广泛，如原料、酒曲、发酵过程中的微生物代谢活动、陈酿过程中发生的化学反应等[53]。在这些来源中，微生物对黄酒风味品质的影响最大，黄酒的风味物质很大程度上决定了黄酒的品质。由于黄酒发酵过程中微生物组成复杂，中国黄酒行业普遍采用纯种酵母发酵。然而，纯种酵母发酵的黄酒微生物群落结构相对简单，导致黄酒的风味不够独特、口感不够醇厚，因此，黄酒发酵过程中微生物菌群结构对香气物质的产生有着重要作用。混合菌种发酵已被证明可以增加黄酒风味的多样性，改善黄酒的品质[54]。在黄酒发酵过程中，酵母菌可将糖转化为乙醇和二氧化碳，同时产生高级醇、酸、酯、醛类等物质，这极大地影响了黄酒的香气。通过添加产酯酵母进行混合发酵，可有效改善黄酒的一些不足之处，如口感偏苦、香气不足、酒精度偏高等问题。

酿造过程中的产酯酵母菌是黄酒发酵过程中产生挥发性芳香化合物的主要菌群。蔡君等[55]采用黄酒酿制复式发酵工艺，酶法活性多肽生物发酵技术酿制新型生物多肽黄酒，在发酵过程中添加假丝酵母AS2.1182和球似酵母AS2.202，以1∶1比例混合，能显著改善黄酒的风味，使黄酒香气更浓郁，口感更舒畅，并且品质要优于传统黄酒。张彭湃等[56]在黄酒酿造过程中同时加入产酯酵母与普通黄酒酵母，进行共同发酵，发现产酯酵母的加入使黄酒香气更浓郁，相比于普通黄酒，加入产酯酵母的黄酒感官评定有较大幅度的提高，总酯含量是黄酒酵母单独发酵酒的1.6倍，检测出酯类物质的种类也多于黄酒酵母单独发酵。YAN S B等[57]分离筛选出一株异常威克汉姆酵母HN006，将该产酯酵母添加于百合黄酒发酵，酿造的黄酒中总氨基酸含量和感官评分更高，此外还产生了更多的酯类、游离脂肪酸、醇类、酮类、酚类等物质，有效增强了百合黄酒的香气。乙酸是黄酒中重要的酸类物质之一，也是合成乙酸乙酯的前体物质，酸类和酯类共同构成黄酒和谐的口感。刘梦等[58]以糯米糖化液为发酵基质，将一株马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）HY32与酿酒酵母TRADY混合发酵，与单一酿酒酵母发酵相比，混合发酵中黄酒发酵液的乙酸乙酯和乙酸含量都有大幅提升，同时发酵液中的酸类、酯类、醛类等物质含量也有所提高，此外，还产生了两种新的风味物质，分别是具有菠萝香气的己酸乙酯和在酒类中起缓冲作用的2,3-丁二醇，混合发酵使酒体醇香浓郁、绵甜柔和，有效改善了黄酒的品质。

3.4 产酯酵母在酱油中的应用

酱油作为一种传统调味品，是我国传统食品行业的一个重要领域，在亚洲各国的饮食文化中也占有重要地位。我国酱油生产主要采用低盐固态发酵工艺，由于其原料利用率高、发酵周期短、生产成本低，故长期以来受到酿造行业人士的青睐。但是，与高盐稀态发酵工艺相比，采用低盐固态发酵工艺酿造出来的酱油风味较差。酱油的酱香和酯香决定了酱油的风味品质，酱油风味是霉菌、细菌和酵母等共同作用的结果，复杂的微生物相互作用在发酵过程中对风味的形成起着至关重要的作用[59]。对酱油风味贡献最大的微生物是酵母菌和乳酸菌，其中关系最密切的酵母菌有鲁氏酵母、易变球拟酵母、埃契氏球拟酵母、无名球拟酵母和酱醪接合酵母[60]，这些酵母大多在发酵后期出现，是产酯类酵母菌，这些酵母菌利用曲霉代谢过程中生成的糖类和氨基酸产生乙醇[61]，随后乙醇与酸反应生成酱油的风味成分。乳酸菌在酱醪发酵过程中可降低发酵醪的pH，不仅能促进鲁氏酵母的繁殖，还能与酵母菌联合生成酱油的特殊香气成分—糠醇。传统的酱油生产是采用天然露晒、自然接种的方式，靠空气中微生物发霉制曲，后来变为纯种酿造，但其生产周期长、酶系单一、产品质量不稳定，且因发酵体系中酶系单一而造成原料无法被彻底分解。为了改善这些缺点，尝试采用多菌种发酵，通过在发酵过程中添加细菌或生香酵母，使多菌种协同发酵，产生更多香气物质的前驱物来提高酱油的风味。

鲁氏接合酵母、假丝酵母和球拟酵母都是酱油生产中常见的生香酵母，这些酵母菌可生成乙醇、高级醇、羟基-呋喃酮类和4-乙基愈疮木酚等[62]，在酱油发酵过程中生成独特的风味物质，其中耐盐性酵母菌则是众多酵母菌中最能为酱油风味作出巨大贡献的酵母菌。李学伟等[63]将耐盐酱油酵母添加到低盐稀态酱油中进行生香发酵，总酸、总酯、酒精度显著提高，醇类和酯类物质提高了接近2倍，且醛类和挥发性酸类物质下降明显，生香发酵后的酱油香气柔和、醇香浓郁。用优良的产香酵母发酵可以增强酱油的风味，JIANG X W等[64]分别在酱油高盐液态醪液中加入三种酵母：粉状米勒酵母（Millerozyma farinosa）、鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis），三种酵母的添加都促进了酱油挥发性酯类物质含量的增加，其中添加Z.rouxii高达到1.03 g/L。WAH T T等[65]研究了Z.rouxii和季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）菌株在泰国酱油发酵中挥发性风味化合物（volatile flavour compound，VFC）生产中的作用，酵母接种增强了醪液中VFC的产生，其中乙醇、醇、呋喃酮、酯、醛、酸、吡喃酮和酚的含量有所提高，这些都是酱油中重要的特征风味化合物。此外，与Z.rouxii的单一培养物相比，协同发酵能产生更多的醇、呋喃酮、酯、麦芽酚和苯甲酸，进而有效增强了酱油的风味。

3 结论与展望

产酯酵母具有较强的产酯能力，同时还能产生酸类、醇类、醛类、酮类等物质，为发酵食品的风味带来重要的作用。到目前为止，产酯酵母的应用仍处于研究阶段，能直接用于生产的产酯酵母菌较少，因发酵食品生产条件导致菌株需要耐受较高的酒精度、较高的盐浓度、较高的温度等特殊性能，因此，产酯酵母的选育有待进一步研究。在发酵食品中，除了考虑添加产酯酵母提高产品的风味和品质以外，可考虑多菌种相互作用、基因工程改造功能菌株等技术手段，提高发酵体系中酯类物质的含量。另外，可利用现代化测序技术、组学技术等进一步研究产酯酵母的作用机理、发酵过程中对微生物变化的影响，探讨产酯酵母与风味物质间形成的关系，从而能科学地指导传统发酵产业的升级，提高经济效益。

目前，产酯酵母的研究应用主要集中在发酵食品方面，加入产酯酵母进行强化发酵，可使发酵过程中短时间内生成芳香物质，缩短发酵周期，降低生产成本，提高产品质量。产酯酵母的发展空间仍然很大，应最大程度利用产酯酵母菌的优势去研究和开发出更多的新型产品，未来可考虑应用于其他领域，如食品酶类的生产和香精香料的生产等，有针对性地选育产酯酵母，不断深入研究，开发新型产品，进行技术革新，提高产品品质。