高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱法分析尿中6种砷形态

刘 洋，陈绍占，刘丽萍*，李晓玉，李乾玉

（1.北京市疾病预防控制中心，食物中毒诊断溯源技术北京市重点实验室，北京 100013；2.首都医科大学公共卫生学院，北京 100069；3.中国食品药品检定研究院，北京 100162）

砷是一种备受关注的环境毒物，人们通过空气、食品和饮用水而发生砷暴露。食品、地下水和饮用水的污染威胁着世界各地人类的健康。砷具有不同的形态，主要有砷甜菜碱（AsB）、砷胆碱（AsC）、砷糖（AsS）、砷酸盐（As（V））、亚砷酸盐（As（Ⅲ））、一甲基砷（MMA）和二甲基砷（DMA）等，不同形态砷的毒性差异较大，无机砷（包括As（V）和As（Ⅲ））通常被认为是毒性较高的砷形态，而甲基化的有机砷危害较小［1－2］，AsB、AsC、AsS通常认为是无危害的砷形态。长期接触无机砷易患皮肤癌、神经系统疾病和肺癌等［3］，对人体健康造成多种危害，《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762－2022）［4］中规定了食品中总砷及无机砷的限量，因此砷形态分析对于食品安全、人体健康至关重要。人体暴露不同毒性的砷形态后对健康的影响差异较大。为了更好评价砷通过食品、环境暴露途径对人体健康的影响，有必要开展人体尿液中砷形态及砷代谢物的分析研究。因此，建立一种分析尿中多种砷形态的方法用于评估砷暴露后的代谢非常重要。

目前尿中砷形态的检测方法主要为高效液相色谱－电感耦合等离子体质谱法（HPLC－ICP－MS）［5－6］、液相色谱－原子荧光法（LC－AFS）［7］、氢化物发生－原子吸收光谱法（LC－HG－AAS）［8］、离子交换色谱－氢化物发生－原子荧光光谱法（LC－HG－ICP－AFS）［9］等。我国卫生标准《尿中砷形态的测定》（WS/T 635－2018）［10］采用LC－AFS法分析尿中砷形态，但此标准只能测定尿中4种砷形态（MMA、DMA、As（Ⅲ）、As（V）），且灵敏度相对较低。HPLC－ICP－MS的灵敏度高、分析种类多、分离好，被广泛应用于砷形态分析。目前采用HPLC－ICP－MS测定尿液中砷形态的分析方法存在分析时间较长［11］、前处理过程中砷形态易发生转化［6］和砷形态种类覆盖不全等问题［12］。为了更好地研究砷暴露后在尿液中的代谢转化情况，亟需建立尿中多种砷形态的分析方法，用于评估砷暴露后的代谢水平，更好地为地方病砷中毒的评价提供有力支持。本文采用HPLC－ICP－MS建立了同时分析尿中6种砷形态的测定方法，并初步考察了人食用海鲜、食用菌等不同含砷食品后人体尿液中砷的存在形式。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（1260型）及电感耦合等离子体质谱仪（7700x型）（美国Agilent公司）；Dionex IonPac As7阴离子交换色谱柱（250 mm × 4 mm，10 µm）及其保护柱Dionex IonPac AG7（50 mm × 4 mm，10 µm）（美国赛默飞世尔科技公司）；Milli－Q超纯水纯化系统（美国Merck公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

AsB、DMA、AsC、MMA、As（Ⅲ）、As（V）的标准溶液均购自中国计量科学研究院；碳酸铵（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Sigma公司）；有证标准物质：“冷冻人尿中砷形态”（NIST SRM 3669）。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件色谱柱：Dionex IonPac As7阴离子交换色谱柱（250 mm × 4 mm，10 µm）和Dionex Ion⁃Pac AG7保护柱（50 mm × 4 mm，10 µm）；流速：1.2 mL/min；进样量：25 µL；流动相：A为20 mmol/L碳酸铵（2%甲醇），B为100 mmol/L碳酸铵（2%甲醇）；梯度洗脱条件为：0 ~ 1.6 min，100% A；1.6 ~5.6 min，100% B；5.6 ~ 8.0 min，100% A。

1.2.2 质谱条件RF入射功率：1 550 W，载气（高纯氩气）流速：0.65 L/min，补偿气流速：0.45 L/min，射频电压：1.80 V，泵速：0.3 r/s，采样深度：8.0 mm。

1.3 样品处理

取1 mL尿样于15 mL聚丙烯离心管中，加入2 mL超纯水稀释，混合均匀，8 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 µm滤膜，上机测定，同时做空白实验。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

正常尿液含有95%的水、1.8%的尿素和1.1%的无机盐。文献多采用不同的试剂将尿液稀释一定倍数，例如Fukai等［13］将尿样与流动相（10 mmol/L丁烷磺酸钠 + 4 mmol/L丙二酸 + 4 mmol/L四甲基氢氧化铵）等比例稀释后过滤取上清液检测；Todor等［14］使用1%硝酸稀释尿液后测定；Nguyen等［6］使用流动相（4 mmol/L碳酸铵 + 0.05% Na2EDTA）和甲醇的混合物稀释尿样，但存在As（Ⅲ）向As（V）转化的现象，Verdon等［15］也发现了这一现象。为减少其他物质的引入，保证尿中砷形态的稳定，目前大多数研究仅将尿液用超纯水稀释后上机测定［16］。当稀释倍数较少，尿液中无机盐含量较高时，尿液中的Cl离子会形成ArCl+，从而干扰质谱检测；稀释倍数过多，则待测物砷形态的含量过低，影响检测的准确性。本实验考察了尿液分别稀释3倍、5倍、10倍的测定结果，发现将尿液稀释3倍既可避免无机盐的干扰，方法灵敏度也能满足要求。因此，选择将尿液稀释3倍后离心处理。

2.2 色谱柱的选择

对于尿中砷形态的测定，目前大多数研究选用Hamilton PRP－X100阴离子交换色谱柱［16－17］，但使用该色谱柱分离6种砷形态需要准确调节流动相pH值，且分离时间较长。考察了Hamilton PRP－X100（250 mm × 4.1 mm，10 µm）、C18反相色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 µm）、Dionex IonPac As19（250 mm ×4 mm）、Dionex IonPac As7（250 mm × 4 mm）等色谱柱的分离效果，在相同的洗脱条件下，前3种色谱柱均无法实现6种砷形态的完全分离。本实验最终选择Dionex IonPac As7为分析色谱柱，该色谱柱在6 min内能使6种砷形态实现基线分离，分离周期仅为8 min，且耐盐能力较强。

2.3 流动相的选择

由于磷酸盐［18－19］和碳酸盐［12，20］体系的洗脱能力强、分析时间短、分离能力好，目前已被广泛应用。但磷酸盐缓冲液存在会出现峰的共洗脱，长期使用时会在ICP－MS仪器的锥口出现积盐等问题［19］。近年来的砷形态研究中也有使用醋酸盐体系［11］作为流动相，其与碳酸盐具有一定的相似性，但醋酸盐的黏度和密度均较低，当以20 mmol/L醋酸铵（pH 5，A）和20 mmol/L醋酸铵（pH 9，B）为流动相采用梯度洗脱时，可在30 min完成6种砷形态的分离，分析时间较长。经优化选择，本实验使用碳酸铵为流动相，操作简便。

分别考察了30 mmol/L碳酸铵等度洗脱（图1a）、30 mmol/L碳酸铵（A）和50 mmol/L碳酸铵（B）梯度洗脱（图1b）、20 mmol/L碳酸铵（A）和100 mmol/L碳酸铵（B）梯度洗脱（图1c）3种洗脱方式的分离效果，结果见图1。与等度洗脱相比，梯度洗脱可以提升As（V）的灵敏度。在梯度洗脱中，B相浓度为50 mmol/L时，虽然各砷形态的灵敏度有所提高，但分析时间较长；对梯度洗脱进一步优化，将B相浓度提高至100 mmol/L时，分析时间大大缩短，且各砷形态的灵敏度较好，8 min内可完成6种砷形态的分离，分离度较好。由于2%甲醇对砷的信号强度具有增敏作用，因此本实验选用20 mmol/L碳酸铵（2%甲醇）（A）和100 mmol/L碳酸铵（2%甲醇）（B）为流动相进行梯度洗脱。

图1 不同流动相对6种砷形态（10 µg/L）分离效果的影响Fig.1 Influence of different mobile phase on the separation effect of 6 arsenic speciations（10 µg/L）

2.4 线性范围与检出限

分别配制0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100 µg/L的6种砷形态混合标准溶液。在最佳实验条件下，采用本方法进行测定，以不同砷形态的色谱峰面积（y）与相应质量浓度（x，µg/L）绘制标准曲线。结果表明，6种砷形态在0 ~ 100 µg/L质量浓度范围内线性较好，相关系数（r）均大于0.999（见表1）。采用逐级稀释法测定检出限，以3倍基线噪声（S/N= 3）时的质量浓度为检出限，得到AsB、DMA、AsC、As（Ⅲ）、MMA、As（V）的检出限分别为0.05、0.05、0.05、0.05、0.05、0.15 µg/L（见表1）。

表1 6种砷形态的线性关系及检出限Table 1 Linear relationships and detection limits of 6 arsenic speciations

2.5 方法的准确性

通过有证标准物质测定和加标回收实验考察方法的准确性。

2.5.1 有证标准物质测定测定有证标准物质“冷冻人尿中砷形态”（NIST SRM 3669），结果见表2。由结果可知，有证标准物质“冷冻人尿中砷形态”中5种砷形态的测定结果均在标准参考值范围内。

表2 冷冻人尿中砷形态（NIST SRM 3669）的测定结果（n = 6）Table 2 Determination results of arsenic speciations in Frozen Human Urine（NIST SRM 3669）（n = 6）

2.5.2 加标回收实验随机选取1份尿样，分别添加10.0、30.0、70.0 µg/L 3个浓度水平的6种砷形态混合标准溶液，进行加标回收实验（见表3）。由表3可知，3个加标水平下6种砷形态的回收率为91.8% ~ 108%，相对标准偏差（RSD）为0.30% ~ 1.9%。

表3 6种砷形态的加标回收率与相对标准偏差（n = 6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations of six arsenic speciations（n = 6）

2.6 方法的重复性

以精密度考察方法重复性，分别进行了模拟样品和实际样品的考察。

在尿样中加入低、中、高3个浓度水平的6种砷形态混合标准溶液，制备模拟样品，测定其砷形态的含量。结果显示，6种砷形态的RSD（n= 6）均小于5.0%。

选取2个含砷的尿样，测定其砷形态，分别测定6次。结果表明，其中1个样品中主要的砷形态为AsB、DMA、AsC、As（V），另1个样品中主要的砷形态为AsB、DMA、As（Ⅲ）、MMA、As（V），其RSD均小于5.0%。

2.7 实际样品的测定

采用所建方法测定近百份尿液样品，结果表明尿中砷分别以AsB、As（V）、As（Ⅲ）、AsC、MMA和DMA的形式存在。尿中砷代谢产物AsB、无机砷（iAs）、MMA、DMA的分布水平反映了人体对砷的代谢情况，食用不同含砷食物后砷的代谢不同，同时有研究报道食用海鲜后尿中各形态砷化合物的代谢存在性别差异［21］。

2.8 方法对比

与其他文献方法相比，本方法的灵敏度、分离度和分析时间均有一定优势。Rodríguez等［11］采用醋酸铵为流动相，Hamilton PRP－X100为色谱柱，梯度洗脱，在30 min内完成6种砷形态分离，其中AsC和AsB的分离度较差，不能满足实际工作的需要；Nguyen等［6］采用碳酸铵为流动相，选用Hamilton PRPX100色谱柱，梯度洗脱，在20 min内仅完成5种砷形态的分离，且As（Ⅲ）的灵敏度较差；Sen等［17］采用含2%甲醇的5 mmol/L（NH4）2HPO4和5 mmol/L NH4NO3为流动相，Hamilton PRP－X100为色谱柱，其中AsC和AsB的分离度较差，且需15 min完成6种砷形态分离。总体而言，本文采用Dionex IonPac As7为分析色谱柱，在8 min内可实现尿中6种砷形态的分离，可满足尿砷形态的分析要求。

2.9 食用不同含砷食物后尿中砷形态分析

为探究食用含砷较高的食物后尿中砷形态的存在形式，研究人体对砷的代谢情况，招募6名志愿者。6名志愿者近3 d均未食用含砷高的食物，其中5名于当日晚餐分别食用皮皮虾、花蛤、海虾、海鱼和松茸，收集第二日晨尿，采用本方法测定尿中砷形态，测定结果见表4，分析谱图见图2。

表4 摄入不同食品后尿中砷形态测定结果（µg/L）Table 4 Determination results of arsenic speciations in urine after ingestion of different foods（µg/L）

图2 不同尿液样品中砷形态的检测谱图Fig.2 Detection spectra of different arsenic speciations in urine samples

由表4可知，食用不同含砷食品后，尿中砷形态的存在形式不同。Y2、Y3号样品中DMA的质量浓度较高，说明食用花蛤和海虾后，尿样中DMA显著增加，该现象与Heinrich－Ramm等［22］的研究结果相似，然而测定花蛤和海虾中砷形态时，主要砷形态为AsB，只含有少量的DMA，推测可能是海鲜中的AsS在人体内代谢为DMA，使得尿液中DMA增加；Y5和Y6号样品中砷形态主要为AsB，AsB是鱼和松茸中砷的主要形态，人体摄入后被迅速排出，在人体中转化较少，该现象已被Petrick［23］和Wildfang［24］等证实。由图2可知，食用皮皮虾、松茸和海鱼后，尿样中AsB增加明显；Y2、Y3、Y4号样品中存在未知峰，即食用花蛤、海虾和皮皮虾后尿液中均存在未知峰X1（保留时间为195 s）和X2（保留时间为200 s），对未知峰砷形态的具体成分有待进一步研究。

3 结 论

本研究建立了尿液中砷形态的高效液相色谱−电感耦合等离子体质谱分析方法，以碳酸铵为流动相，可在8 min内完成6种砷形态分析，操作简便，不同浓度水平的加标回收率为91.8% ~ 108%，RSD均小于5.0%，有证标准物质—冷冻人尿中砷形态（NIST SRM 3669）的测定值在标准值参考范围内。结果表明，该方法具有灵敏度高、分析时间短、精密度好、准确可靠等优点，适用于尿中砷形态的分析，特别适合大批量尿液样品的快速分析。通过对摄入不同食物志愿者尿液中的砷形态进行测定，发现摄入不同食物后尿中的砷形态差异较大。该研究可为机体砷代谢特征和健康效应的研究提供方法支持。