基于通过式固相萃取净化的液相色谱－串联质谱法测定猪肉中5种肽类抗生素

刘 真，王玉梅，胡文彦

（南京市食品药品监督检验院，江苏 南京 211198）

肽类抗生素，又称抗菌肽，是在动植物、微生物体内产生的一类具有生物活性的抗生素，包括达托霉素、多粘菌素、杆菌肽、维吉尼亚霉素、万古霉素等［1］。由于其可抗革兰氏菌、真菌和病毒等效用，被广泛用作兽药添加到动物饲料中，用于预防、治疗动物传染病，促进饲料转化率和提高动物的生长速度。肽类抗生素一般被视为最后防线药物，过量使用或者不遵循休药期使用，将导致动物源性食品中肽类抗生素残留通过食物链传递给人类，长期积累会导致肝肾毒性，不仅产生食品安全问题，也会引发人们对抗药性的强烈担忧［2－3］。因此，国内外均出台了相应法规限制肽类抗生素的使用以及设定动物源性食品中的限量。我国兽药最大残留限量标准GB 31650规定猪肉中维吉尼亚霉素M1的限量为100 µg/kg［4］；农业农村部公告第250号规定猪肉中禁用肽类抗生素万古霉素及其盐、酯［5］，其他肽类抗生素的限量标准也在陆续制定中，但配套的检测方法仍不够完善。因此，针对日常消费量巨大的猪肉这一食用农产品，构建一种多种肽类抗生素高通量快速检测方法具有重要的实际应用价值。

目前仅有杆菌肽、粘杆菌素、维吉尼亚霉素M1［6］、万古霉素有相应的国标检测方法，但方法的检测目标物单一、检测对象不全面、检测步骤也较繁琐，不利于对肽类抗生素的监管应用。此外，新一代的环脂肽类抗生素—达托霉素因对革兰氏阳性菌的治疗作用优于其他肽类抗生素得到广泛应用［7－8］，目前国内外报导了饲料、血浆等基质中达托霉素的分析方法［3，9－10］，然而针对动物源性食品中达托霉素的分析研究仍未见报道，造成监管盲区，有较大安全隐患。鉴于液相色谱－串联质谱法（HPLC－MS/MS）具有灵敏度和准确度高的特点，已成为分析检测领域的可靠技术手段［11－13］，本研究基于HPLC－MS/MS技术，针对猪肉中达托霉素及潜在风险较高的4种肽类抗生素（包括万古霉素、去甲万古霉素、维吉尼亚霉素M1、维吉尼亚霉素S1）建立了同时定性定量测定方法，以期弥补监管空白，为打击违法滥用肽类抗生素提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

AB SCIEX QUAD 5500液相色谱－串联质谱联用仪（美国AB SCIEX公司），配置电喷雾离子源（ESI）及MultiQuant数据处理系统；Sorvall LYNX 4000低温高速离心机（美国Thermo Fisher公司）；LP Vortex Mixer涡旋振荡器（美国Thermo Fisher公司）；Fluko FA25均质器（上海弗鲁克科技发展有限公司）。甲醇、乙腈（色谱纯，德国Meker公司）；甲酸（色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份公司）；实验用水为Milli－Q超纯水；Captiva EMR－Lipid固相萃取小柱（300 mg/3 mL，美国Agilent公司）；有机尼龙滤膜（0.22 µm，天津市津腾实验设备有限公司）；猪肉样品（购于南京农贸市场）。

达托霉素（含量99.9%，上海源叶生物科技有限公司）；盐酸万古霉素（96.4%，北京曼哈格生物科技有限公司）；盐酸去甲万古霉素（99.0%）、利血平（87.7%）均购自中国食品药品检定研究院；维吉尼亚霉素M1（1 000 µg/mL）、红霉素（99.9%）购自坛墨质检科技股份有限公司；维吉尼亚霉素S1、罗红霉素（100 µg/mL，天津阿尔塔科技有限公司）。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液的配制：分别准确称取固体标准品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到质量浓度为1 mg/mL的达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素、利血平、红霉素单标储备液，−20 ℃避光保存，有效期3个月；分别准确吸取维吉尼亚霉素M1、S1及罗红霉素标准溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，得到质量浓度为100 µg/mL维吉尼亚霉素M1单标储备液和质量浓度为10 µg/mL维吉尼亚霉素S1、罗红霉素单标储备液，−20 ℃避光保存，有效期1个月。

混合标准溶液的配制：分别准确吸取0.01 mL达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素单标储备液，0.1 mL维吉尼亚霉素M1储备液和1 mL维吉尼亚霉素S1储备液于10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸稀释至刻度，混匀得到5种肽类抗生素的混合标准工作溶液，质量浓度为1 µg/mL，临用现配。

混合内标标准溶液的配制：分别准确吸取0.01 mL利血平、红霉素单标储备液，1 mL罗红霉素单标储备液于10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸稀释至刻度，混匀得到混合内标标准溶液，质量浓度为1 µg/mL，临用现配。

溶剂标准工作曲线的配制：分别准确吸取1、2、5、10、20、50、100、200、500 µL前述混合标准溶液，均加入10 µL混合内标标准溶液，用乙腈−0.1%甲酸水溶液（5∶95，体积比）定容至1 mL，标准工作曲线质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL，内标质量浓度均为10 ng/mL，临用现配。

基质匹配标准工作曲线的配制：分别准确吸取1、2、5、10、20、50、100、200、500 µL前述混合标准溶液，均加入10 µL混合内标标准溶液，用空白基质提取液定容至1 mL，得到基质匹配标准工作曲线质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL，内标质量浓度均为10 ng/mL，临用现配。

1.3 样品前处理

准确称量猪肉样品2 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入100 µL混合内标标准溶液，加入10 mL甲醇−2%甲酸（5∶2，体积比），均质提取2 min，涡旋振荡提取3 min，10 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液过免活化的Captiva EMR－Lipid固相萃取小柱净化，弃掉1 mL前流出液，收集后续净化液，过0.22 µm有机尼龙滤膜待上机测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex F5（2.1 mm × 100 mm，2.6 µm）；柱温为40 ℃；进样量5 µL；流动相为0.1%甲酸（A）及0.1%甲酸乙腈溶液（B），流速为0.3 mL/min；流动相梯度为：0.0 ~ 1.0 min，95% A；1.0 ~ 2.0 min，95% ~ 40% A；2.0 ~ 4.0 min，40% ~ 23% A；4.0 ~ 4.5 min，23% ~ 2% A；4.5 ~6.0 min，2% A；6.0 ~ 6.1 min，2% ~ 95% A；6.1 ~ 8.0 min，95% A。

1.5 质谱条件

电喷雾离子源正模式扫描（ESI +）；离子化电压（IonSpray vltage）：5 500 V；气帘气（Curtain gas）：206.85 kPa（30 psi）；喷雾气（Ion source gas 1）：379.22 kPa（55 psi）；辅助加热气（Ion source gas 2）：379.22 kPa（55 psi）；碰撞气（Collision gas）：Medium；离子源温度（Temperature）：550 ℃。检测方式：多反应监测（MRM），离子对信息见表1。其中罗红霉素为达托霉素、万古霉素及去甲万古霉素定量分析的内标，利血平为维吉尼亚霉素M1及维吉尼亚霉素S1定量分析的内标。

表1 5种肽类抗生素及2种内标物质的质谱参数Table 1 MS parameters of five peptide antibiotics and two internal standards

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的选择

2.1.1 质谱条件的优化达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素、维吉尼亚霉素M1、维吉尼亚霉素S1属于肽类大分子抗生素，分子量为525.59 ~ 1 620.67［14－15］，其中达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素的分子量超过1 000，因此传统的小分子质谱离子对优化方法难以电离其碎片离子对。

本实验在质谱入口处连接上三通装置，接头1用于泵入初始比例流动相，接头2用于补充泵入1%甲酸水溶液，以增加目标物质在正模式下的电离程度，接头3用于泵入1 µg/mL的单标标准溶液，通过优化碰撞能及裂解电压，得到各目标物响应最佳的一对离子对用于定性定量分析（见表1），其中达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素的母离子带双电荷，维吉尼亚霉素M1、维吉尼亚霉素S1的母离子带单电荷。

2.1.2 色谱条件的优化在色谱条件的优化中，本实验重点考虑了有机相种类、水相的pH值与成分，以及色谱柱的类型，并基于色谱峰的峰形、峰面积、分辨率和保留时间综合考虑最优色谱条件。分别考察了适合大分子物质分析的Phenomenex Kinetex F5（2.1 mm × 100 mm，2.6 µm）和Waters Pep⁃tide CSH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 µm）色谱柱的分离效果，发现后者分离的目标物峰形不佳，多刺，且灵敏度较低，因此选择Phenomenex Kinetex F5（2.1 mm × 100 mm，2.6 µm）为最佳色谱柱。

在该色谱柱上，考察了甲醇和乙腈两种常用流动相试剂，发现乙腈有助于实现更佳的色谱峰形和色谱分辨率，且在乙腈中添加0.1%甲酸可改善峰面积响应，因此确定0.1%甲酸乙腈溶液为有机相。进一步比较0.1%乙酸、0.1%甲酸和0.2%甲酸的分离效果，发现增强酸性后，各物质的峰形更佳，但酸性增至0.2%甲酸时，目标物质的响应均显著降低，综合考虑选用0.1%甲酸作为水相。在选用0.1%甲酸乙腈溶液和0.1%甲酸为流动相的基础上，通过调整流动相的梯度比例，可使目标物质实现有效的洗脱分离和最佳质谱响应，获得各物质的MRM特征离子色谱图见图1。

图1 5种肽类抗生素及2种内标物质的MRM特征离子色谱图Fig.1 Typical MRM chromatograms of 5 peptide antibiotics and 2 internal standards

2.2 前处理方法的选择

2.2.1 提取溶剂的优化由于本文关注的5种肽类抗生素溶解性有差异，其中达托霉素易溶于甲醇和水，万古霉素、去甲万古霉素易溶于酸性水溶液，微溶于甲醇，而维吉尼亚霉素M1和维吉尼亚霉素S1易溶于甲醇［16］，因此考虑使用甲醇及甲酸水溶液的混合溶剂对猪肉中以上物质进行提取。

首先优化提取溶剂中的甲酸含量，考察了体积比均为1∶1的甲醇−2%甲酸、甲醇−1%甲酸和甲醇−0.1%甲酸对提取效果的影响，发现甲醇−1%甲酸提取溶液上机后各目标物质峰形均很差，难以定量，而甲醇−2%甲酸的提取回收效果整体比甲醇−0.1%甲酸的好，因此确定使用甲醇−2%甲酸。进一步对不同体积比（1∶6、2∶5、3∶4、5∶2、6∶1）的甲醇−2%甲酸进行优化，发现随着水相比例的增大，肉样中提取出的油及浮沫增多，不利于后续净化及过滤膜上机，而甲醇比例越大，提取的上清液越澄清；当各目标物质加标水平相同时，不同体积比的甲醇−2%甲酸水溶液的提取效果如图2所示（n= 3）。随着混合提取溶液中甲醇比例的增加，维吉尼亚霉素M1、维吉尼亚霉素S1及达托霉素的峰面积响应明显增强，但体积比为6∶1时维吉尼亚霉素M1、维吉尼亚霉素S1的提取率误差较大，重复性较差，且万古霉素、去甲万古霉素的峰面积响应降低。综合考虑，确定体积比为5∶2的甲醇−2%甲酸为最佳提取试剂，此时5种肽类抗生素的回收率最好。

图2 不同体积比甲醇－2%甲酸对5种肽类抗生素的提取效果Fig.2 Extraction efficiencies of five peptide antibiotics under different volume ratios of methanol－2% formic acid

2.2.2 净化方法的优化由于猪肉样品基质复杂，提取溶液中含有大量脂溶性杂质，不利于质谱分析的稳定性，且批量进样对离子源存在污染，因此需要对提取溶液进行净化。通常肽类抗生素的净化采用传统的Oasis HLB固相萃取柱［17－19］，净化流程包括固相萃取柱的活化和平衡、上样、淋洗及洗脱等过程，步骤耗时繁多；50 µg/kg加标水平下各物质的加标回收率如图3A所示，其中维吉尼亚霉素M1、维吉尼亚霉素S1能实现较好的回收效果，但达托霉素的高亲水性及其与Oasis HLB固定相的弱结合力导致其在淋洗中损失严重，而万古霉素和去甲万古霉素由于采用纯甲醇为洗脱试剂未能得到有效洗脱，造成回收率较差。

图3 不同净化方式对5种肽类抗生素回收率的影响Fig.3 Effect of different purification methods on recoveries of five peptide antibiotics

本实验选择了两款新型的免活化通过式固相萃取柱（Captiva EMR－Lipid和Oasis PRiME HLB小柱）用于除脂以净化提取液，同时考察了仅采用正己烷除脂的净化效果（见图3B）。结果显示，Captiva EMR－Lipid小柱的净化效果最好。目标物仅采用正己烷净化时的回收率低可能是由于待净化溶液由甲醇与甲酸水溶液组成，而正己烷与水会少量互溶从而导致目标物损失，采用Oasis PRiME HLB小柱的回收率较差可能是由于该净化柱在除脂过程中对目标物产生吸附作用所致。

2.2.3 内标物的选择使用优化的提取方法进行样品前处理后，采用溶剂标准曲线定量时得到5种肽类抗生素的回收率约为50%，因此考虑引入内标物减小基质效应，实现更准确的定量分析。通常使用目标物的同位素内标，以获得与目标物几乎一致的色谱行为，减小基质效应［20］。然而本实验考察的5种目标物，仅达托霉素及万古霉素有商品化的同位素内标纯品（达托霉素-D5及万古霉素-D12），且价格昂贵。参考已有文献［10，21］，本实验选择3种常用物质（利血平、红霉素、罗红霉素）作为内标进行考察。实验结果显示，在优化的梯度洗脱条件下，3种内标物的保留时间分别为3.31、3.05、3.20 min，与5种肽类抗生素的出峰时间相近，适宜作为内标使用；但红霉素作为内标时，5种目标物的加标回收率（以50 µg/kg为例）均远超100%，不同目标物的定量结果达到加标量的2 ~ 6倍，说明当前的样品前处理条件下，红霉素与5种目标物的回收效果差异大，不适合作为内标物。以罗红霉素和利血平作为内标分别对5种肽类抗生素进行定量分析，确定达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素使用罗红霉素作为内标，维吉尼亚霉素M1和维吉尼亚霉素S1使用利血平作为内标，此时5种肽类抗生素的回收率为90.0% ~ 110%，不仅降低了检测成本，也能满足定量需要。

2.3 方法学考察

2.3.1 基质效应参考文献［22－23］，对本方法涉及的猪肉中5种肽类抗生素的基质效应（ME）进行考察。针对内标法及外标法两种定量方式均配制相同系列浓度的标准工作曲线，即溶剂标准工作曲线和基质匹配标准工作曲线，计算公式为ME（%） = （Slopematrix/Slopesolvent−1） × 100，其中Slopematrix为基质匹配标准工作曲线斜率，Slopesolvent为溶剂标准工作曲线斜率，如果|ME| > 50，表明存在强基质效应；20 < |ME| < 50，表明存在弱基质效应；|ME| < 20，表明无基质效应。结果表明（见表2），除维吉尼亚霉素S1的基质效应较弱外，其他几种组分在外标法定量时均表现出强的基质抑制效应，而使用内标法定量后基质抑制效应明显改善，因此本实验选用内标法进行定量校正。

表2 5种肽类抗生素的基质效应、线性方程、线性范围、检出限及定量下限Table 2 MEs，linear equations，linear ranges，LODs and LOQs of five peptide antibiotics

2.3.2 线性范围、检出限与定量下限本方法采用罗红霉素作为达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素的内标，利血平作为维吉尼亚霉素M1和维吉尼亚霉素S1的内标，以待测物及内标的质量浓度比作为横坐标（x），以待测物及内标的峰面积比作为纵坐标（y）绘制标准曲线，对待测样液进行定量分析。结果显示，达托霉素在2 ~ 200 ng/mL范围内，万古霉素及去甲万古霉素在5 ~ 500 ng/mL范围内，维吉尼亚霉素M1及维吉尼亚霉素S1在1 ~ 100 ng/mL范围内均呈良好线性关系，相关系数（r2）均大于0.99。于猪肉空白基质溶液中添加不同水平的5种肽类抗生素混合标准溶液，以定量离子的信噪比为3和10分别确定各物质的检出限（LOD）为3 ~ 7.5 µg/kg，定量下限（LOQ）为5 ~ 25 µg/kg（见表2）。

2.3.3 回收率与相对标准偏差针对市购空白猪肉样品，采用标准加入法考察3个不同加标水平（25、50、250 µg/kg）下5种肽类抗生素的回收率及相对标准偏差（RSD），每个水平进行6次重复实验（n= 6）计算日内精密度（Intra-RSD），对各加标水平连续测定3 d（n= 18）计算日间精密度（Inter-RSD），结果见表3。3个加标水平的平均回收率为80.2% ~ 102%，Intra-RSDs为1.3% ~ 7.4%，Inter-RSDs为2.6% ~8.5%，表明方法的重复性好，回收率佳。

表3 5种肽类抗生素的回收率及相对标准偏差Table 3 Recoveries and RSDs of five peptide antibiotics

2.4 实际样品的检测

采用本方法对30批市售猪肉样品进行5种肽类抗生素的测定，其中1批检测出维吉尼亚霉素M1，检出值为68.5 µg/kg，其余29批未检出以上肽类抗生素，图4为阳性样品的提取离子色谱图（EIC）。

图4 阳性猪肉样品中维吉尼亚霉素M1的提取离子色谱图Fig.4 EIC chromatogram of virginiamycin M1 in a positive pork sample

3 结 论

本文基于Captiva EMR－Lipid免活化固相萃取小柱，构建了猪肉中达托霉素、万古霉素、去甲万古霉素、维吉尼亚霉素M1及维吉尼亚霉素S1 5种肽类抗生素的液相色谱－串联质谱分析方法。方法的样品前处理简便，回收率好，重复性佳，适用于猪肉中5种肽类抗生素的一针同时定性定量分析，尤其是弥补了当前食品中达托霉素检测技术的空白。利用构建的方法对市售实际样品进行检测，发现1批检出维吉尼亚霉素M1的阳性样品。本方法的开发为猪肉中肽类抗生素的风险监测提供了技术支撑，也为其他动物源性食品基质中相关肽类抗生素的检测技术研发提供了思路。