hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血清中的表达及临床意义研究

庄晓旭， 曾苑娴， 冼中任， 刘安琪， 胡国艳

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤的首位，且近年来的发病率呈逐渐增高的趋势[1]。早期乳腺癌可行手术切除联合放化疗治疗，总体治愈率为90%左右；但对于晚期患者，其5年生存率尚不足40%[2]。因此，早期诊断乳腺癌并及时治疗对改善患者预后，提高生存率至关重要。目前乳腺癌的筛查技术主要有：乳腺查体、医学检验、X线摄影、超声检查、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、正电子发射断层显像术(positron emission computed tomography，PET)、医学影像引导细胞学穿刺检查、影像基因组学和微波成像等[3]。组织病理检查仍是乳腺癌诊断的金标准，但临床上尚缺乏一种可早期诊断乳腺癌的分子标志物。目前应用最广泛的乳腺癌肿瘤标志物是癌抗原153(cancer antigen 153，CA153)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，但特异度不理想[4]。环状RNA(circular ribonucleic acid, circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子，随着高通量测序技术和生物信息学的发展，人们在真核细胞发现了大量circRNA[5]，且某些circRNA可以发挥竞争性内源RNA的作用来调控基因表达，还可以作为microRNA(miRNA)海绵来影响基因的调控和表达[6-8]。由于circRNA没有3＇端、5＇端和poly A尾，为封闭的环状结构，可以避免核酸外切酶和核糖核酸酶的降解作用，因此更加保守和稳定。张艳娜等[9]研究发现hsa_circ_0001785的表达与乳腺癌增殖、转移有关。鉴此，本文通过检测乳腺癌及乳腺良性肿瘤患者血清中的hsa_circ_0001785表达水平，探讨hsa_circ_0001785作为乳腺癌诊断标志物的应用价值。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2021年9月至2022年3月广州医科大学附属第五医院甲乳外科收治的乳腺癌患者43例(乳腺癌组)，年龄20～79(52.00±12.00)岁；乳腺良性肿瘤患者54例(良性肿瘤组)，年龄18～63(35.00±11.00)岁，均经病理检查明确诊断。收集同期于健康体检中心接受健康体检的健康者45名(健康对照组)，年龄19～72(36.00±11.00)岁。通过医院电子病历系统收集乳腺癌组患者的临床资料。本研究获医院医学伦理委员会批准(KY01-2022-02-09)，研究对象知情同意。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：(1)乳腺癌组：符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2019年版)》[10]中关于乳腺癌的诊断标准；(2)良性肿瘤组：经影像学或组织病理学检查确诊为良性肿瘤；(3)健康对照组：①无乳腺功能障碍性疾病；②无良恶性肿瘤病史；③免疫肿瘤标志物CEA、CA153、癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)结果在正常参考范围值内。排除标准：(1)肿瘤广泛全身性转移；(2)合并其他部位肿瘤；(3)合并严重器官功能障碍；(4)预计生存期<3个月；(5)妊娠期妇女；(6)已进行肿瘤治疗。

1.3主要实验仪器和试剂

1.3.1 实验仪器 微量分光光度计(型号：Nano-300，ALLSHENG杭州奥盛仪器有限公司)，罗氏Cobas e801全自动电化学发光分析仪，基因扩增仪[规格型号：TC-96/G/H(b)C]，实时荧光定量PCR仪(规格型号：Cobas z480，美国)，离心管、涡旋震荡器，离心机。

1.3.2 实验试剂 游离RNA提取试剂盒[GSPureTM Cell-Free RNA(cf RNA) l solation Kit，吉赛生物，中国]，逆转录试剂盒(Hifair Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit，YEASEN Biotech Co.)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)试剂盒(AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix，诺唯赞生物)。CEA、CA153、CA125检测试剂盒(罗氏诊断公司，电化学发光法)。

1.4血清CEA、CA153、CA125检测 收集研究对象外周血4 ml，3 000 r/min离心5 min，收集血清，-20 ℃保存备检。通过电化学发光法检测血清CEA、CA153、CA125表达水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5hsa_circ_0001785水平检测 使用游离RNA提取试剂盒提取研究对象血清样本的总RNA，并用分光光度计检测其纯度。通过逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行qPCR，反应体系为：cDNA 3 μl，上、下游引物各0.4 μl，2×SYBR Green Master Mix 10 μl，dH2O 6.2 μl。qPCR条件为：95 ℃预变性反应5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，40个循环。引物序列见表1。根据2-ΔΔCt法，以U6为内参计算hsa_circ_0001785相对表达量。

表1 引物序列

2 结果

2.1三组血清hsa_circ_0001785表达水平比较 qPCR实验结果显示，三组血清hsa_circ_0001785表达水平比较差异有统计学意义(F=5.926，P=0.003)。乳腺癌组血清hsa_circ_0001785表达水平显著高于良性肿瘤组和健康对照组(P<0.05)，良性肿瘤组和健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

乳腺癌组 vs 良性肿瘤组，*P=0.027；乳腺癌组 vs 健康对照组，**P=0.006；良性肿瘤组 vs 健康对照组，P=0.821

2.2血清hsa_circ_0001785与肿瘤标志物CEA、CA125、CA153诊断乳腺癌的效能分析结果 纳入乳腺癌患者(乳腺癌组)和非乳腺癌患者(良性肿瘤组+健康对照组)数据进行ROC曲线分析，结果显示，血清hsa_circ_0001785、CEA、CA125均具有良好的乳腺癌诊断效能(P<0.05)，且以hsa_circ_0001785诊断效能最佳(AUC=0.780)。见图2，表2。

图2 血清hsa_circ_0001785与肿瘤标志物CEA、CA125、CA153诊断乳腺癌的ROC曲线图

表2 血清hsa_circ_0001785与肿瘤标志物CEA、CA125、CA153诊断乳腺癌的ROC曲线分析结果

2.3乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785与肿瘤标志物CEA、CA125、CA153的相关性分析结果 Pearson相关性分析结果显示，乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785与肿瘤标志物CEA、CA125、CA153均无显著相关性(r=-0.126，P=0.303；r=-0.140，P=0.271；r=-0.131，P=0.305)。

2.4乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785表达水平与临床特征的关联性分析结果 43例乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785的表达水平与其年龄、肿瘤类型、TNM分期、淋巴结受累、远处转移、雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)均无显著关联(P>0.05)。见表3。

表3 乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785表达水平与临床特征的关联性分析结果[M(P25，P75)]

3 讨论

3.1乳腺癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，在世界范围内每年约有140万例患者被确诊为乳腺癌，因乳腺癌死亡的女性患者达50万例[11]。近年来，随着诊断和治疗策略的不断发展，乳腺癌的死亡率逐年下降，但乳腺癌仍是导致女性癌症死亡的主要原因[12]。乳腺癌的发生和发展是多因素共同作用的结果。研究表明，circRNA的异常表达与乳腺癌的发生和发展密切相关[13]。血液肿瘤标志物的检测样本易于获得，且采样创伤小，目前应用较多的乳腺癌肿瘤标志物有CEA、CA125、CA153等，但其特异性和灵敏性均不够理想。本研究结果也显示CEA、CA125、CA153诊断乳腺癌的特异度高，但灵敏度低，对乳腺癌的早期诊断价值不大。

3.2circRNA是一类高度稳定的非编码RNA，circRNA的共价环状闭合结构使其不易被核酸酶降解，不仅生物学性质稳定，而且具有时空特异性、生物进化保守性等优点[14]。circRNA可以作为miRNA“海绵”，通过竞争性结合miRNA，降低miRNA对其靶基因的抑制作用，从而调节基因和蛋白的表达，参与多种生理和病理过程[15]。随着基因芯片和高通量测序技术的发展，越来越多的学者发现包括circRNA在内的非编码RNA的差异表达有望成为乳腺癌早期筛查的生物标志物及潜在的治疗靶点[16]。研究表明，大部分circRNA来源于编码基因和全外显子，可以翻译并编码蛋白质[17]。circRNA的功能包括：(1)充当miRNA“海绵”。circRNA上存在miRNA的结合位点，可以与miRNA结合从而调控肿瘤的生长发育过程。(2)调控宿主基因的表达。circRNA通过与RNA相互作用，参与调控基因的转录、表达。(3)翻译蛋白质。虽然大多数circRNA不具有结合核糖体进行翻译的能力，但研究数据显示少数内源性circRNA可以通过N6-甲基腺苷修饰或内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)被翻译成蛋白质或多肽进而发挥作用[18]。

3.3由于circRNA呈闭合环状，故在生物体内具有较好的稳定性[14]，有较好的临床应用前景。越来越多的研究表明circRNA与多种肿瘤的发展密切相关，并在乳腺癌组织中发现了多种有差异表达的circRNA[19]。Zhou等[20]通过对乳腺癌组织和癌旁组织进行高通量RNA测序发现有85个circRNAs在乳腺癌组织中表达升高，67个circRNAs在乳腺癌组织中表达降低；且沉默hsa_circ_0011946可以抑制复制因子C亚基3(replication factor C subunit 3，RFC3)的表达，沉默hsa_circ_0011946可以抑制乳腺癌细胞MCF7的迁移和侵袭。Wang等[21]通过对乳腺癌组织和癌旁组织进行微阵列芯片分析发现circRNA-000911在乳腺癌细胞中的表达水平明显降低，作为miR-449a的“分子海绵”，circRNA-000911通过“吸收”miR-449a从而调控miR-449a对Notch1基因的抑制作用，进而抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进乳腺癌细胞的凋亡。Tang等[22]发现hsa_circ_0001982在乳腺癌组织和细胞中表达水平明显升高，下调hsa_circ_0001982可以提高miR-143的表达水平，进而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，诱导乳腺癌细胞凋亡。Liang等[23]发现circ-ABCB10在乳腺癌组织中的表达水平显著升高，沉默circ-ABCB10可以上调miR-1271的表达进而抑制乳腺癌细胞MCF7细胞的增殖并促进其凋亡。

3.4hsa_circ_0001785是最近新发现的癌症相关circRNA。Yin等[24]通过对乳腺癌患者和健康志愿者的血浆样本进行circRNA表达谱分析发现，hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血浆中表达异常，且与患者的组织学分级(P=0.013)、TNM分期(P=0.008)和远处转移(P=0.016)存在显著关联，可以作为诊断乳腺癌的生物标志物(AUC=0.784)。本研究结果也显示，hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血清中呈高表达，且具有诊断乳腺癌的应用价值(AUC=0.780)，且诊断效能较CEA、CA125、CA153更优。值得注意的是，本研究中CEA、CA125、CA153对乳腺癌的诊断特异度达100%。但在常规肿瘤筛查中，CEA、CA125、CA153并不是乳腺癌的特异性指标，其结果异常并不能排除其他肿瘤的发生。因此，可以考虑将hsa_circ_0001785与CEA、CA125、CA153进行联合检测，从而提高早期乳腺癌的检出率。

3.5有研究显示circRNA的表达与乳腺癌的肿瘤分期、组织学分级、肿瘤远处转移、ER阳性密切相关[24]。但在本研究中，血清hsa_circ_0001785的表达水平并未显示出与乳腺癌患者年龄、肿瘤类型、TNM分期、淋巴结受累、远处转移、ER、PR、HER2等临床特征具有显著关联。这可能与本研究为回顾性研究，部分患者的临床指标信息缺失等有关，而且本研究纳入分析的病例数较少，这也对统计结果造成了一定的影响，故仍需继续扩大样本量通过前瞻性研究来进一步验证hsa_circ_0001785与患者临床病理指标的关联性。

综上所述，血清高水平表达的hsa_circ_0001785与乳腺癌的发生密切相关，其在乳腺恶性肿瘤患者和良性肿瘤患者间的表达亦存在差异，这使hsa_circ_0001785有望成为诊断乳腺癌的新标志物，但关于hsa_circ_0001785在乳腺癌发生、发展中的具体作用机制还有待进一步研究。