反相高效液相色谱法检测金线莲中槲皮素、山奈酚含量

黎霞， 何佳， 王建栋， 申屠文姬， 王红珍

(浙江农林大学 亚热带森林国家重点实验室培育基地，浙江 杭州 311300)

金线莲为兰科开唇兰属植物花叶开唇兰、金线兰的全草，具有保肝护肝、抗炎、镇静和镇痛、凉血祛风、除湿解毒等作用，主治肺结核咯血、糖尿病、咯血、尿血等症[1]。金线莲主要分布于中国福建、浙江、江西等热带、亚热带地区，在日本、泰国、越南等国也有稀疏分布[1-2]，其天然蕴藏量稀少，种子在自然条件下发芽率极低，再加上人类过度采挖和对生态环境的破坏，其野生资源濒危。2016年12月发布的《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)将其列入附录Ⅱ的保护物种，《国家重点保护野生植物名录》(第二批)列为二级保护植物。目前，市场上金线莲产品主要是人工栽培苗，但因为缺乏金线莲质量评价标准，市场上金线莲产品质量参次不一，鱼目混珠现象时有发生，严重损害了消费者利益，使消费者健康受损。

黄酮类物质为金线莲主要活性成分，具有抗炎、抗氧化的效果[3]。本文通过优化金线莲槲皮素、山奈酚提取参数，建立了金线莲中槲皮素、山奈酚提取方法并分析该方法的精确性，并对不同栽培时间金线莲和金线莲不同组织中槲皮素、山奈酚含量进行了分析。本研究将为金线莲栽培标准和质量标准制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

样品采自福建漳州金线莲种植基地，经浙江农林大学中药学科胡润怀教授、植物学科教授金水虎鉴定为花叶开唇兰(A.roxburghii(Wall.) Lindl)。

RE-2000旋转蒸发仪，KQ-500DE数控超声波清洗仪，Waters-2695高效液相色谱仪(美国waters)，waters-2996检测器(美国waters)，Aglient TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱(美国Aglient)。槲皮素、山奈酚对照品(批号为100081-201408、0861-200001)购自中国食品药品检定研究院。色谱级甲醇(德国Merck)，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱Waters C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇∶0.2%磷酸溶液(体积比50∶50)，流速1 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长360 nm。

1.2.2 对照曲线配制

精密称取槲皮素、山奈酚对照品，溶于甲醇中，配置成浓度为2.75、0.75 mg·mL-1混合母液，依次稀释2、4、8、16、32倍，每个浓度上样20 μL，测定目标峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，进行线性回归。槲皮素、山奈酚回归方程分别为Y=65 901X-3 133 270，r=0.998 5；Y=769 481X-2 489 683，r=0.999 8。槲皮素、山奈酚在0.04～2.75、0.011～0.750 mg·g-1呈良好线性关系。

1.3 提取方法的优化

1.3.1 最佳溶剂的选择

准确称量0.1 g金线莲粉末，按料液比1∶10分别加入甲醇∶盐酸10∶1、乙醇∶盐酸10∶1、去离子水∶盐酸10∶1的溶剂中，静置40 min，60 ℃水浴中超声90 min后，样品经0.45 μm滤膜过滤，进样20 μL，反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测槲皮素、山奈酚提取率。

1.3.2 最佳混合溶剂选择

称取0.1 g金线莲粉末，按料液比1∶10分别加入甲醇含量不同的混合溶剂∶盐酸10∶1的溶剂中，静置40 min，60 ℃水浴中超声90 min，经0.45 μm滤膜过滤，进样20 μL，RP-HPLC检测混合溶剂中甲醇含量对槲皮素和山奈酚提取效率。混合溶剂中甲醇含量分别为70%、80%、85%、90%、95%、100%。

1.3.3 最佳料液比选择

在最佳混合溶剂∶盐酸10∶1中，分别以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50中加入0.1 g金线莲粉末，静置40 min，60 ℃水浴中超声90 min后，样品经0.45 μm滤膜过滤，进样20 μL，RP-HPLC检测混合溶剂中甲醇含量对槲皮素和山奈酚提取率。

1.3.4 超声最佳水浴温度的选择

在最佳混合溶剂∶盐酸10∶1，以最佳料液比加入0.1 g金线莲粉末，静置40 min，分别在50、60、70、80 ℃水浴中超声90 min。60 ℃水浴中超声90 min后，样品经0.45 μm滤膜过滤，进样20 μL，RP-HPLC检测槲皮素和山奈酚提取率。

1.4 精密度试验

1.4.1 精密度试验

取对照品混合液，连续进样6次，每次进样20 μL，测定槲皮素、山奈酚峰面积。测定槲皮素、山奈酚峰面积相对标准偏差(RSD)，RP-HPLC检测的精密度。

1.4.2 重复性试验

取样品6份，按1.3节中优化的方法制备样品溶液，测定槲皮素、山奈酚峰面积，检测槲皮素、山奈酚RSD，确定试验重复性是否良好。

1.4.3 稳定性试验

对照品母液按照1.3中的方法制备。分别在0、12、24、36、48 h进样20 μL，测定槲皮素、山奈酚的RSD，确定目标物质检测的稳定时间。

1.4.4 回收率试验

精密称取0.1 g全草干粉6份，加入对照品母液1 mL，按1.3节中优化的方法制备样品溶液，进样20 μL，测定槲皮素、山奈酚的质量分数，计算槲皮素、山奈酚的平均回收率。

1.5 不同栽培时间和不同组织中槲皮素和山奈酚含量

分别称取不同栽培时间及同一栽培时间下金线莲根、茎、叶和全草0.1 g，在1.3节中优化的方法制备样品溶液，样品溶液经0.45 μm滤膜过滤，进样20 μL，RP-HPLC检测槲皮素和山奈酚提取效率。

2 结果与分析

2.1 最佳条件优化

2.1.1 溶剂类型对提取效率的影响

图1显示，槲皮素和山奈酚在10∶1的甲醇∶盐酸溶剂中提取效率均最高。

图1 溶剂类型对提取效率的影响

2.1.2 混合溶剂中甲醇含量对提取效率的影响

由图2可知，当甲醇含量为90%时，槲皮素和山奈酚的提取效率最高。

图2 混合溶剂中甲醇含量对提取效率的影响

2.1.3 料液比对提取效率的影响

由图3可知，当料液比为1∶40时，金线莲中槲皮素、山奈酚的提取效率最高。

图3 料液比对提取效率的影响

2.1.4 超声时水浴温度对提取效率的影响

由图4可知，70 ℃水浴的提取效果最好。

图4 水浴温度对提取效率的影响

2.1.5 超声时间对提取效率的影响

由图5可知，超声处理90 min金线莲中槲皮素、山奈酚的提取效率最高。

图5 超声时间对槲皮素、山奈酚提取效率的影响

综上所述，提取金线莲中槲皮素、山奈酚的最佳方法为：按料液比1∶40加入甲醇∶盐酸10∶1的溶剂，静置40 min，70 ℃水浴中超声90 min。

2.2 精密度试验

2.2.1 精密度试验

取对照品混合液，连续进样6次，槲皮素、山奈酚峰面积RSD分别为2.37%、1.03%，表明RP-HPLC检测体系精密度准确。

2.2.2 重复性试验

取样品6份，按1.4节中优化的方法制备样品溶液，槲皮素、山奈粉RSD分别为2.68%和2.07%，表明试验重复性良好。

2.2.3 稳定性试验

对照品母液按照1.3节中的方法制备。分别在0、12、24、36、48 h进样20 μL测定槲皮素、山奈酚峰面积，其RSD分别为1.53%、1.57%，表明目标物质在48 h内稳定。

2.2.4 回收率试验

精密称取0.1 g全草干粉6份，加入对照品母液1 mL，按1.4节中优化的方法制备样品溶液，进样20 μL，测定槲皮素、山奈酚的质量分数，计算槲皮素、山奈酚的平均回收率分别为95.23%、98.23%。

2.3 不同栽培月龄及不同组织中目标物质分布

准确称量不同月龄金线莲根、茎、叶和全草的干粉(0.1 g)，按料液比1∶40加入95%甲醇∶盐酸10∶1的混合溶剂4 mL，静置40 min，称重。置于70 ℃水浴中超声90 min，放至室温，补至超声前质量，离心并经0.45 μm滤膜过滤，20 μL上样。测定槲皮素、山奈酚峰面积，计算样品中槲皮素、山奈酚的质量分数。

表1显示，槲皮素在不同栽培月龄金线莲的叶中含量最高，根、茎中含量极低或者检测不到，全草含量略低于叶，且3个月栽培月龄金线莲的叶含量最高，为1.29 mg·g-1，全草中含量为0.54 mg·g-1。不同栽培月龄金线莲不同组织中，山奈酚的分布无明显差异(0.44～0.53 mg·g-1)，其中，3个月栽培月龄的叶中含量最高，约为 0.53 mg·g-1。

表1 槲皮素、山奈酚在花叶开唇兰中的分布

3 小结与讨论

黄酮醇是自然界存在最广泛的黄酮类物质，近年研究表明，黄酮醇具有抗癌、抗氧化和抗炎作用[11-12]，槲皮素、山奈酚是具有代表性的黄酮醇[13]。

金线莲含有丰富的黄酮类化合物，且槲皮素、山奈酚多以黄酮醇苷元形式存在[8-10,14]。因此，在测定槲皮素、山奈酚含量的过程中，采用有机溶剂和盐酸(10∶1)的混合溶剂，通过酸水解反应，将黄酮醇苷水解成黄酮醇苷元，再测定其含量。在含量测定过程中，有机溶剂类型、浓度以及水浴温度、超声时间等都会影响黄酮醇含量的测定，因此，本文对这些条件进行优化，最后确定槲皮素、山奈酚提取的最佳条件。

黄酮类化合物呈弱酸性，因此首先用乙腈∶甲醇∶0.5%醋酸铵溶液为流动相，槲皮素、山奈酚保留时间分别为8.110、13.951 min，分离度良好。但是，在测试样品时，槲皮素与杂质峰没有完全分开。本文采用福建金线莲中黄酮类物质的含量所用的流动相甲醇∶0.2%磷酸50∶50[13]，槲皮素、山奈酚出峰时间13.037、22.639 min，色谱峰分离良好，和杂质峰也完全分开。

金线莲大棚栽培阶段，槲皮素、山奈酚均呈现先升后降的趋势，移栽3个月时，全草中槲皮素、山奈酚含量最高，移栽4个月时开始呈下降趋势。研究结果与蒋元斌[15]的结果一致，槲皮素、山奈酚最高含量出现的时间可能因为移栽月份不同而有差异。槲皮素在金线莲叶中含量最高，在茎、根中的含量很低，低至用现有的方法检测不到。山奈酚在叶中的分布略高于茎和根。槲皮素、山奈酚在叶中含量高于茎中，且变化趋势与全草相同，该结果与蒋元斌对不同栽培时期福建金线莲、台湾金线莲中槲皮素、山奈酚的动态变化一致。