苗医隔药纸火灸法对椎动脉型颈椎病模型兔SOD、MDA 及椎动脉血管形态学影响*

蒙自己 黎喜平 唐东昕 姜运琼 何 静 肖淦辰

（1.贵州中医药大学硕士研究生2000 级，贵州 贵阳 550002；2.贵州中医药大学第一临床医学院，贵州 贵阳 550002；3.贵州中医药大学护理学院，贵州 贵阳 550002）

椎动脉型颈椎病（Cervical spondylosis of vertebral artery type，CSA）是临床常见疾病，以椎动脉刺激或者受压后出现椎-基底动脉缺血而出现的系列症状：头晕、头痛、耳鸣、视力障碍、平衡障碍、听力减退等[1，2]。目前西医治疗无效果确切的具体方法，如药物治疗只是对症处理，暂时缓解症状，对原发病没有作用，而手术虽然可以处理原发病但是风险高、创伤大，不能为广大患者接受，另由于手术未针对病因治疗，长期疗效难以保证[3]。

苗族医药是苗族人民在长期与疾病斗争的实践中产生的，拥有一系列具有民族特色的医理理论、用药理论、诊法理论、治法理论及预防理论，经苗医学科收集的苗医隔药纸火灸法（是集火疗、药疗于一体的复合疗法，该法用料由火、科室自制黑骨藤追风液、纱布、草纸4 个部分组成）经长期临床实践对颈椎病疗效确切[4]。目前研究表明[5，6]CAS 发病机制与椎-基底动脉缺血相关，其缺血机制之一与体内SOD 降低致过氧化物（以MDA 为代表）过高，脂质代谢异常后椎动脉血管壁损伤有密切联系。因此，课题组拟通过CSA 兔模型之SOD、MDA 及椎动脉血管形态学等指标观测以初步揭示苗医隔药纸火灸法治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 新西兰大白兔9 只，2～2.5 kg，雄性，普通级，许可证号：SCXK 赣2018-0009，江西省赣州市畜牧研究所，温度20～26 ℃，湿度40%～70%。实验试剂与仪器：黑骨藤追风液（组方：黑骨藤500 g，活麻根250 g，小血藤250 g，透骨香250 g，四块瓦250 g，追风伞250 g，将其全部浸泡于3500 mL 55°米酒中1 个月后备用）；消痔灵注射液（吉林省集安益盛药业股份有限公司，国药准字Z22026175）；颈部阻燃棉；超净高级封片胶（YZB，BASO）；伊红染色液（G1100，Solarbio）；Scott 蓝化液（G1865，Solarbio）；药品冷藏柜（BYC-310，山东博科生物产业有限公司）；显微镜（CX41 OLYMPUS）；切片机（2235，Leica）；D31（NB600-562SS，Novus）；VEGF（19003-1-ap，proteintech）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301，中杉金桥）；DAB 显色试剂盒（CW0125，CWBIO）；中性树脂（CW0136，CWBIO）；苏木素染色（AR1180-1，博生德生物产业有限公司）。药品冷藏柜（BYC-310，山东博科生物）；SOD 活性检测试剂盒（BC0170，Solarbio）；MDA 含量检测试剂盒（BC0020，Solarbio）。

1.2 模型制备及分组 实验分为3 组正常对照组（Control）、CSA 模型组（Model）、苗医隔药纸火灸法治疗组（Treatment），每组3 只，所有兔子先用脱毛剂将左侧自枕后及颈部的体毛脱掉。除正常组均常规构建椎动脉型颈椎病兔模型[7]，之后进行局部麻醉。抽取硬化剂消痔灵注射液10 mL 注射于兔左侧C3～C5颈椎横突侧面，分别于第2、4、6、8 周重复注射1 次，以造成兔椎动脉周围形成无菌性炎症及瘢痕组织，从而造成椎动脉型颈椎病动物模型。造模后苗药治疗组进行干预处理，固定模型兔为俯卧位，暴露颈部，皮肤消毒，将装有药液的容器瓶放入40 ℃左右的温水中进行加热处理，将加热的药液倒入弯盘中，再放6 层纱布充分吸收药液，将吸收药液的纱布平铺于关节面上，再七层草纸热水浸润平铺于药液纱布上，周围覆上阻燃棉保护非治疗区域，用直钳夹持浸有95%酒精的燃烧棉球，在纱布上做“蜻蜓点水”状连续敲击，持续1～2 min，用保鲜膜覆在敲击部位上进行保温2～3 min，再次点燃棉球进行敲击加温的动作，重复4 次，每次5 min，共治疗20 min，隔日治疗1 次，每周3 次，在造模后的第8、10、12、14、16、18、20、22、24 天，各治疗1 次，共治疗9 次。干预后处死各组兔子，取颈部肌肉组织，进行HE 染色后分析椎动脉血管壁中膜厚度，取外周血样本，生化试剂盒检测其中SOD 和MDA 的水平。

1.3 HE染色 取出组织流水冲洗数小时，经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，纯酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min（至透明为止）。放入二甲苯和石蜡各半的混合液15 min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50～60 min。石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，返蓝液返蓝15 s，流水冲洗，伊红染色3 min，流水冲洗，脱水，透明，封片，镜检。

1.4 生化检测 所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品和样品，做复孔。配制好试剂盒各种组分的工作液，可按试剂盒说明书中试剂准备中描述的方法操作。

分光光度计预热30 min 以上，调节波长至560 nm，蒸馏水调零。SOD 测定前将试剂一、三和五7 ℃（哺乳动物）或25 ℃（其他物种）水浴5 min 以上。样本测定，充分混匀，37 ℃水浴30 min 后，置于1 mL 玻璃比色皿测定560 nm 下的吸光度，分别记为A 测定、A 对照、A1 空白、A2 空白，计算ΔA 测定=A 测定-A 对照，ΔA空白=A1 空白-A2 空白。如底部有沉淀，混匀后再行测定。全自动酶标仪（WD-2102B，北京六一）仪器预热30 min 以上，蒸馏水调零，按照表格加样，混合液在100 ℃水浴中保温60 min 后（盖紧，防止水分散失），置于冰浴中冷却，10 000 g，常温，离心（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号TGL-16.5M，半径6.26 cm，3500 r/min）10 min。取上清至1 mL 玻璃比色皿中，测定各样本在450 nm、532 nm 和600 nm 处的吸光度，分别计算ΔA450=A450 测定-A450 空白，ΔA532=A532 测定-A532 空白，ΔA600=A600 测定-A600 空白。

1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件进行统计分析。所有实验重复3 次，定量结果采用（）表示。显著性分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 病理检查观察椎动脉血管形态 HE 结果可以看出，与正常对照组相比，模型组动脉中膜平滑肌细胞肥大，血管内皮皱褶排列紊乱；与模型组相比，苗医隔药纸火灸法组管壁中膜平滑肌细胞肥大明显受到抑制，血管内皮皱褶较匀称。见图1。

图1 兔子椎动脉型颈椎血管形态（HE染色）

2.2 生化检测 与正常对照组比较，模型组MDA 含量明显增加，苗医隔药纸火灸法组含量明显减少，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；与正常对照组比较，模型组SOD 含量明显减少，而苗医隔药纸火灸法组SOD 含量明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 生化检测椎动脉SOD和MDA含量

3 讨论

苗医无“颈椎病”的病名记载，病名分类不如中西医细致，常将颈椎病归属于“风类疾病”（指因风寒湿毒入侵所导致疼痛、肿胀、痉挛甚至眩晕为主的一类疾病）。苗医认为气、血、水构成人体三要素，也是形成颈椎间盘、椎骨、血脉及肌肉的物质基础。由于毒和乱影响人体，惠气的运化、防病能力减弱，血液的生成及运行发生障碍，局部组织濡养不足，毒素不得清除而留滞，气血水运行受阻，气血水不能通过筋脉滋养颈部组织，能量不足则使得颈项部椎动脉供血不足，最终导致椎动脉型颈椎病的发生。

苗医隔药纸火灸作为体现“四大筋脉学说”苗医理论的经典特色疗法，它结合药疗、火疗于一体，取火性通散，药性祛毒的原理而成。在治疗部位覆盖浸泡过药液的纱布和草纸，通过火把持续敲打促使黑骨藤追风药液更有效渗入疼痛部位，从而将筋脉内留滞的寒邪排出体外，达到通气散血止痛的目的，也体现“气以通为用，血以散为安”的苗医治疗理念。

本研究苗医隔药纸火灸法所采用的黑骨藤追风液由黑骨藤、小血藤、活麻根、透骨香、追风伞、四块瓦及米酒配制而成。方中的领头药（苗医配方将药物分为领头药、铺底药和监护药，与中药配方之“君、臣、佐使”异曲同工）为黑骨藤、小血藤、活麻根，均为根茎部入药，具有舒经活络，除湿止痛作用；铺底药为透骨香、追风伞、四块瓦，均为全草入药，具有除湿通络止痛之效，增强领头药除湿止痛之功效；监护药米酒性热，缓解领头药、铺底药的劣性和毒副作用，同时引药入经，督促诸药共达病所。

本研究结果表明苗医隔药纸火疗法对椎动脉型颈椎病模型兔治疗后，可明显促使体内血清MDA 含量明显减少、SOD 含量明显增加，从组织形态学也证实其对损伤的椎动脉管壁有修复作用。初步揭示了苗医隔药纸火灸法治疗椎动脉型颈椎病的机制，本疗法在操作步骤上易于掌握，值得进一步推广。