基于网络药理学探讨熟地黄-山茱萸治疗2型糖尿病的作用机制

曲国林 付丹妮 迟鹏程 甄 东▲

1.内蒙古民族大学医学院，内蒙古通辽 028000；2.内蒙古民族大学附属医院，内蒙古通辽 028000

糖尿病是以胰岛素抵抗或胰岛素作用障碍引起的高血糖为特征的代谢性疾病，具有遗传易感性。我国糖尿病患病率持续升高，给我国公共卫生带来了极大的负荷[1]，糖尿病中发病率最高的为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）。中医理论认为糖尿病属于“消渴”范畴，中医所云的消渴症可分为上、中、下三消，即病情的轻度、中度、严重[2-3]。下消一般病在肾虚，又有阴虚及阴阳两虚之别。熟地黄-山茱萸药对是治疗肾病的常用药对[1]。熟地黄是生地黄的炮制加工品，其外表光泽乌黑，质地柔软坚韧，味道甘甜，性微温，主要治疗肝脏、肾脏虚弱、心跳悸动怔忡、月经不调等病症[4]。山茱萸性微温、味道微酸，有滋补活络、涩精固脱的功效，主治腰痛酸软、阳痿遗精、小便次数多等病症[4]，两者配伍多用于补肾填精、益精填髓。

中药具有多途径、多成分、多靶点的特点[5]。而糖尿病也是多基因、多通路作用的疾病，所以，应用网络药理学这一系统和网络工具分析并预测熟地黄-山茱萸治疗糖尿病的分子机制是可行的[6-7]。故本研究运用网络药理学方法，从中药成分-靶点-通路-疾病角度探讨熟地黄-山茱萸治疗T2DM可能的作用机制，为后续研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 熟地黄-山茱萸活性成分的收集与筛选

运用BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/中药分子机制的生物信息学分析工具）数据库收集熟地黄和山茱萸所有的有效活性基因分子[8]，在设置参数处选用分数截至值为20，P值为0.05，然后进行筛选，得到其有效活性成分[9]。

1.2 对T2DM的作用靶点及熟地黄-山茱萸的活性成分靶点进行预测

运用OMIM（online Mendelian inheritance in man）（https://omim.org/）数据库，DisGeNET（http://www.disgenet.org/）数据库，GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库，以“T2DM”为关键词进行检索，对T2DM的靶点进行筛选。对BATMANTCM数据库筛选出的熟地黄、山茱萸可能的靶点与Drugbank（https://www.drugbank.ca/）数据库筛选出的靶点进行分析，预测可能的有效活性成分靶点[10]。

1.3 活性成分-靶点网络构建

将筛选得到的活性成分靶点导入软件中，进行可视化分析，绘制活性成分-靶点网络图[11]。

1.4 构建活性成分-靶点-T2DM网络图

以“T2DM”为输入项进行搜索，将DisGeNET、OMIM、GeneCards数据库筛选出的靶点导入Cytoscape3.7.2，构建“T2DM-靶点”网络图，并将疾病靶点与活性成分靶点输入在线Venny平台，获得交集靶点，然后将所获得的数据导入Cytoscape3.7.2软件当中绘制出“活性成分-靶点-T2DM”网络图。

1.5 进行基因的GO分析和通路分析

运 用DAVID数 据 库 和Metascape（http://metascape.org/）数据库以P＜ 0.01作为标准进行GO富集分析以及KEGG功能注释。

2 结果

2.1 筛选收集出熟地黄以及山茱萸的有效活性成分

运用BATMAN-TCM数据库筛选出熟地黄以及山茱萸的有效活性成分共54种，其中熟地黄8种、山茱萸46种。

2.2 熟地黄以及山茱萸成分-靶点网络图的构建

进一步筛选出熟地黄、山茱萸共19种有效活性成分（score大于48）及相对应的靶点256个节点和319条边组成活性成分-靶点网络图（图1），每个活性成分对应多个靶点。在19种活性成分对应靶点中，根据所显示节点数量，成分靠前的分别是Alpha-corocalene、Aristolone、Isoamyl Alcohol、Isotetrandrine，可初步认为其为药物中发挥主要作用的成分。

图1 熟地黄-山茱萸成分所对应的靶标

2.3 构建熟地黄-山茱萸活性成分-靶点-疾病网络图

通过GeneCards、OMIM、DisGeNET数据库收集到的T2DM的作用靶点共1183个，筛选出作用靶点450个（相关数值大于0.5），二者相互交集的靶点24个（图2）。所得数据导入至Cytoscape软件，绘制建立出有效成分-靶点-疾病网络图（图3）。

图2 熟地黄-山茱萸活性成分靶点与T2DM靶点关系Venn图

图3 熟地黄-山茱萸有效成分-靶点-疾病网络图

2.4 GO通道路径富集分析

GO富集分析发现交集靶点主要富集269个生物学过程（BP）、55个细胞成分（CC）以及90个分子功能（MF）中，分别根据富集倍数数值选择其中最高的前10位绘制富集气泡图（图4～6）。GO富集分析结果显示，细胞成分（图4）中富集倍数较大的有细胞质、细胞外液、细胞外区、质膜等，生物学过程（图5）主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控、基因表达的正向调节、信号转导等，分子功能（图6）主要富集在蛋白质结合、酶结合、细胞因子活性等。

图4 细胞成分分析（前10位）

图5 生物学过程分析（前10位）

图6 分子功能分析（前10位）

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG功能注释分析发现主要富集在24条通路（图7），与营养信号通路、胰岛素抵抗、神经活性配体-受体相互作用等关系相对密切，提示熟地黄-山茱萸可能通过营养成分介导胰岛素等方面治疗T2DM。

图7 有效成分及疾病作用靶点的KEGG富集通道路径分析

3 讨论

T2DM发病趋势连年升高，发病机制主要为患者自身胰岛素分泌受限[12]。部分T2DM患者以胰岛素抵抗为主，血液中的胰岛素升高以代偿其胰岛素抵抗[13-15]。糖尿病在中医中被称为“消渴”，患者多为阴虚火旺盛体质，由饮食无节制、好食肥甘厚味、缺少运动、经常久坐等诸多因素造成，临床表现为阴气虚弱气火旺盛、津伤燥结、淤积气血等，熟地黄、山茱萸是中医常用补肾填精复方药对之一。本研究基于网络药理学方法，从中药成分-靶点-通路-疾病角度预测熟地黄、山茱萸药对治疗T2DM的分子机制。

本研究通过收集活性成分靶点、疾病靶点进行可视化分析，得到成分-疾病的交集靶点，最后进行功能注释富集分析。GO富集分析发现生物学过程主要富集在对基因的调节、调控等方面。KEGG的通道路径富集分析发现其涉及如营养信号通路、胰岛素抵抗等多条信号通路。胰岛素抵抗发生有多种机制，如线粒体功能障碍、氧化应激及炎症等。研究发现o-glcnac水平提升与高糖引发导致的胰岛素抵抗有关，供体udp-glcnac通过己糖生物合成途径诱导，通过o-glcnac转移酶添加到蛋白质中，o-glcnac修饰的提高改变了胰岛素信号转导蛋白的功能和磷酸化，导致胰岛素信号传导级联减弱[13，16-17]。另外，本研究存在一定的局限性，在后续网络药理学的进一步分析中应加入活性化合物和活性靶点的分子对接验证,以进一步说明熟地黄-山茱萸药对治疗T2DM的分子机制。同时，后续还需在体内验证网络药理学预测机制。

综上所述，本研究基于网络药理学，发现熟地黄-山茱萸可能通过营养治疗以及介导胰岛素等多途径治疗T2DM，为后续研究提供方向。