乳腺非特殊型浸润性癌外泌体microRNA表达谱探讨

颜 晨 周文斌

1.攀枝花学院基础医学院，四川攀枝花 617000；2.深圳市人民医院 暨南大学第二临床医学院 南方科技大学第一附属医院普通外科（乳腺甲状腺专科），广东深圳 518020

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[1-2]。2021年美国癌症协会数据显示乳腺癌的新发病例数在所有癌症中位居第一[3]。2015年国内乳腺癌发病率在中国女性所有癌症中位居第一[4]。乳腺非特殊型浸润性癌是最常见的乳腺癌组织学类型[5]。近年来液体活检成为一种快速非侵入性的新型肿瘤检测方法，其使用的生物学标志物不仅能同步跟踪乳腺癌进展，为临床诊疗提供信息，还能研究癌症发生的潜在分子机制[6]。很多肿瘤相关研究指出外泌体能在细胞间传递信息，在肿瘤发生发展中起到非常重要的作用[7-8]。据报道外泌体转运的microRNA进入靶细胞可调节mRNA转录，进而影响肿瘤多种生物学过程[9]。因此本研究通过测序比较早期和晚期乳腺非特殊型浸润性癌患者和正常人群血浆中外泌体microRNA差异，寻找具备筛查潜力的外泌体microRNA，评估外泌体microRNA作为乳腺非特殊型浸润性癌诊断血液标志物的潜在应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3—5月深圳市人民医院（我院）乳腺非特殊型浸润性癌早期患者5例、晚期患者5例作为研究对象。纳入标准：①经病理学诊断确认为乳腺非特殊型浸润性癌；②早期组肿瘤组织小于2 cm，无淋巴结及远端转移，晚期组肿瘤已经发生远端转移；③血常规、尿常规和心脏、肝脏、肾脏功能基本正常。排除标准：①妊娠期或哺乳期妇女；②合并其他恶性肿瘤患者；③具有严重的代谢性疾病及血液功能障碍患者；④严重感染患者。另选择我院同期健康女性体检者2例作为对照组。纳入标准：临床资料齐全、无心脑血管、肺、肝、肾疾病。排除标准：出血性脑血管病、肿瘤患者，严重的肝肾功能不全、血液系统疾病及自身免疫缺陷疾病患者。早期组5例，年龄43～67岁，平均（53.40±10.14）岁；晚期组5例，年龄42～63岁，平均（49.40±8.14）岁；对照组2例，年龄47～51岁，平均（49.00±2.83）岁。所有入组者均为女性，三组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 外泌体提取 使用抗凝管采集入组者6 ml血液样本，离心后收集血浆，冻存于-80℃。应用ExoQuick Precipitation试剂盒进行外泌体提取，具体方法参照说明书：血浆样本中加入外泌体提取试剂离心后，沉淀重悬于4倍血浆样本体积的10 mM的PBS中。1.2.2 microRNA提取和测序 应用Trizol法进行外泌体总RNA提取，具体方法如下：在外泌体样本中加入适量Trizol试剂再加入氯仿，混匀后离心，在上层水相加入2倍体积异丙醇，静置后离心得到RNA沉淀，经75%乙醇洗涤和再溶解后冻存于-80℃。在RNA两头加上linker，应用PCR法对产物进行纯化和扩增。应用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离microRNA，并通过胶回收试剂盒回收microRNA后，应用Illumina Hiseq 2500进行测序。

1.2.3 测序数据分析 应用Fastx toolkit软件（版本号：0.0.14）去除下机数据中低质量数据，应用FastQC软件（版本号：0.13.0）进行测序数据质量控制。应用miRTarBase数据库中的人类成熟microRNA数据作为参照序列和测序结果进行比较和标注；使用RPKM作为基因定量表达单位。

应用edgeR方法分析差异基因表达数据，差 异 基 因 筛 选 阈 值 为：|log2（FoldChange）|＞1且P＜0.05。使用R语言软件（版本号：3.6.3）对microRNA表达数据[log10（RPKM+1）]进行层次聚类分析。应用miRTarBase数据库进行microRNA靶基因预测；应用topGO软件对差异表达基因进行GO富集分析；基于KEGG数据库，应用KOBAS软件进行的差异表达基因的通路分析。应用OncoLnc工具进行预后分析。

1.3 统计学方法

所有数据使用SPSS 19.0统计学软件进行统计学分析，采用Fisher’s检验比较不同组间差异外泌体microRNA表达情况，P＜ 0.05为差异有统计学意义，P＜ 0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 早期和晚期乳腺非特殊型浸润性癌组外泌体microRNA表达情况

测序数据经处理后，分析结果显示与正常组比较，早期和晚期乳癌组中的外泌体microRNA表达量均发生变化，具体如下：与正常组比较，晚期组有30个外泌体microRNA表达量上调，差异有统计学意义（P＜ 0.05），早期组有26个外泌体microRNA表达量上调，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与正常组比较，晚期乳腺癌有29个外泌体microRNA表达量下调，差异有统计学意义（P＜ 0.05），早期组有18个外泌体microRNA表达量下调，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与正常组比较，晚期乳腺癌有11个外泌体microRNA表达量上调，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），早期组有11个外泌体microRNA表达量上调，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）。与正常组比较，晚期乳腺非特殊型浸润性癌组有5个外泌体microRNA表达量下调，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），早期组有3个外泌体microRNA基因表达量下调，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）。这些表达量有差异的外泌体microRNA具有潜在的诊断应用价值。

2.2 差异外泌体microRNA聚类分析

根据不同组间差异外泌体microRNA表达情况变化绘制火山图，见图1A；层次聚类分析结果显示不同组间可根据差异外泌体microRNA表达数据成功聚类，见图1B。说明这些差异外泌体microRNA可用来区别乳癌组及健康组，具有潜在的应用价值。

图1 差异外泌体microRNA分布与聚类图

2.3 差异外泌体microRNA通路分析

预测差异外泌体microRNA的靶基因后，再通过GO（The Gene Ontology）分析这些靶基因在生物过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）上的富集情况，以及这些靶基因在KEGG信号通路上的富集情况，取前20条最显著富集通路进行交叉比较，结果见图2；与正常组比较，差异外泌体microRNA靶基因富集通路有95%～60%的富集通路同时出现在早期和晚期乳癌组。这种重叠性说明这些差异外泌体microRNA同时在乳腺非特殊型浸润性癌的发生和转移中发挥作用。

图2 差异外泌体microRNA靶基因前20条最显著富集通路交叉比较韦恩图

2.4 差异外泌体microRNA预后分析

选取与对照组比较，在早期和晚期乳癌组中表达量变化且差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）的外泌体microRNA进行预后分析，结果见图3。这说明图中4个外泌体microRNA的表达量与预后具有一定的相关性，具有潜在的研究价值和临床应用价值。

图3 差异外泌体microRNA在乳腺非特殊型浸润性癌预后分析

3 讨论

外泌体是一种细胞外囊泡[7-8]。microRNA能够通过诱导靶基因降解起到翻译抑制作用[9]。研究表明外泌体microRNA能够在细胞间传递信息，影响肿瘤发展进程，是一种理想的肿瘤非侵入性生物标志物[9]。

本研究发现有4个外泌体microRNA有潜力同时适用于早期和晚期乳腺非特殊浸润性癌的血液学诊断，它们分别是miRNA-451a、miRNA-493-5p、miRNA-409-3p和miRNA-151a-5p。关于miRNA-151a-5p目前还没有在乳腺癌方面的报道，但有报道称其会在肝癌患者中发生显著性减少而在恶性甲状腺癌中会发生显著上升[10-11]；关于miRNA-409-3p，有报道称其与宫颈癌细胞增殖及顺铂化疗敏感性相关[12]，其在小细胞肺癌中可靶向抑制Beclin-1的表达，从而影响化疗药物敏感性[13]；关于miRNA-493-5p，报道称其可以通过调控VAMP2的表达来抑制肝癌细胞的成长发育、诱导其衰老凋亡[14]；关于miRNA-451a，有报道称其和乳腺癌细胞的上皮间质转化相关[15]。

本研究从临床样本出发，基于真实和客观的已知病例情况，围绕“应用外周血外泌体microRNA作为乳腺癌生物学标志物”开展研究，提供可用于乳腺癌血液学检测的外泌体microRNA，为外泌体microRNA检测成为一种无创的乳腺癌血液学检测方法提供理论参考。