Box-Benhnken响应曲面法优化大花紫薇中科罗索酸的提取工艺

林艾和 朱培芳 李 蓉 夏宗霄 龙小妹 郭 爽 范 源,2*

1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学第二附属医院，云南 昆明 650216

大花紫薇(LagerstroemiaspeciousL.)，又名大叶紫薇(Lagerstroemiaflos-reginaeRetz)，是千屈菜科(Lythraceae)紫薇属(Lagerstroemia)的落叶乔木[1]。其原产于亚洲热带，分布于斯里兰卡、印度、马来西亚、菲律宾等地区[2]，在我国广东、广西地区有较丰富的资源。

上世纪90年代起，日本、美国以及菲律宾学者开始系统研究大花紫薇化学成分及功能[3]，其广泛用于治疗糖尿病及肾病[4]，在多个国家已经被开发为茶饮料，广泛用于治疗和预防糖尿病，被誉为“天然植物胰岛素”[5]，此外，其还具有减脂、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等作用[6]。近年来，随着对大花紫薇的研究深入，发现其降血糖的活性成分主要是鞣质类[5,7-8]和三萜类成分[9-10]，其中三萜类主要活性成为科罗索酸[11]，其具有胰岛素样作用且可抑制α-淀粉酶和α-糖苷酶活性[12-14]。

科罗索酸(corosolic acid，CA)，又名 2α-羟基熊果酸[15]，具有降血糖、改善糖尿病性肾损伤、抗肿瘤、抗炎、降血压、抗菌等药理作用[16-19]。其主要存在于大花紫薇、枇杷、北五味子等植物中[20]，现关于在大花紫薇中提取CA相关报道较少，本实验研究建立大花紫薇中CA HPLC 定量分析方法，同时采用响应曲面法优化其提取工艺，为在大花紫薇中提取CA的工艺研究和对大花紫薇的后续开发利用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 YL-040S 语路超声波清洗机，深圳市即洁超声科技有限公司；Agilent 1200 高效液相色谱仪，DAD检测器，AcclaimC30色谱柱(2.1 mm×150 mm，3 μm),美国 Agilent 公司；DFY-600 摇摆式高速万能粉碎机，永康式速锋工贸有限公司；D2KW-D 电热恒温水浴锅，上海量壹科学仪器有限公司；T-1000 型电子天平，上海浦春计量仪器有限公司；AB265-S 十万分之一分析天平，Mettler-Tolido International Trade(Shanghai)Co.LTD；旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司。

试剂：科罗索酸(CA 批号：wkq20042404，纯度≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司)。甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

药材：大花紫薇LagerstroemiaspeciousL.(批号：P20200819，安国市旭芳中药材经营有限公司)经云南中医药大学李国栋副教授鉴定为千屈菜科Lythraceae紫薇属Lagerstroemia植物大花紫薇的干燥全草。

2 方法与结果

2.1 样品测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：AcclaimC30色谱柱(2.1 mm×150 mm，3 μm)；流动相：甲醇(B)-乙腈(C)-0.1%磷酸水溶液(D)；梯度洗脱:0 ～10 min 75% B，12.5% C，12.5% D；10～20 min 70% B，15% C，15% D；流速：0.1 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：20 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按科罗索酸计算应不低于 5000，分离度大于1.5。色谱图如图1所示。

A

BA.对照品溶液；B.供试品溶液；1.科罗索酸图1 高效液相色谱图

2.1.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取CA对照品2.40 mg，置 10 mL 量瓶中，用甲醇配制成CA浓度分别为0.240 mg/mL 的混合对照品溶液，低温避光保存。

2.1.3 供试品溶液制备 取干燥的大花紫薇，粉碎，过 40 目筛，精密称定约 2.0 g，置于圆底烧瓶中，加热回流，提取温度90℃，设置不同料液比、加热回流时间、回流次数及乙醇体积分数，合并提取液，过滤。滤液于 60 ℃减压回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解后移至 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 线性关系考察 取“2.1.2”项下混合对照品溶液，0.45 μm 微孔滤膜膜过滤，依次精密吸取2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL， 按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。 CA的回归方程为y=604.24x+1.1333(R2=0.9999)，线性范围为 0.480～2.880 μg。

2.1.5 精密度考察 精密吸取同一混合对照品溶液 10 μL，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样 6 次，结果CA的峰面积RSD 为1.13% ，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，于室温放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h，按“2.1.1”项下色谱条件，以峰面积为指标进样分析，结果CA面积 RSD 为1.44%，表明供试品溶液在10 h 内稳定。

2.1.7 重复性试验 取同一批样品 6 份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，结果显示CA平均含量为2.3246 mg/g, RSD 为 1.28%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批样品(每 1.0 g 大花紫薇含CA 2.3246mg)粉末 6份，每份精密称取 1.0 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，加入CA对照品适量(约相当于 1.0 g 样品中所含CA的量)，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率。结果见表 1。

表1 大花紫薇中CA加样回收率试验表

2.2 单因素实验 采用加热回流法提取大花紫薇中的科罗索酸，将料液比、加热回流时间、回流次数及乙醇体积分数作为影响因素，固定其中3个因素，以提取率为评价指标，对另一个因素进行单一因素实验。固定提取时间为60 min，提取次数为1次，料液比为1∶10 g/mL，考察乙醇体积分数(75%、80%、85%、95%、100%)对提取率的影响，优选最佳乙醇体积分数，按所优选条件依次向下考察料液比(1∶10 g/mL、1∶15g/mL、1∶20 g/mL、1∶25 g/mL)，提取时间(40 min、60 min、80 min、100 min、120 min)，提取次数(1次、2次、3次)对醇提的影响。

结果图2表明，CA含量随乙醇体积分数升高而增加，由于CA是脂溶性物质，不溶于水，随着乙醇体积分数的增加其含量增加，当乙醇体积分数为95%和100%时，CA含量相差不明显，考虑实验成本，故选择乙醇体积分数为 95%[21]；CA含量随料液比从1∶10 g/mL到1∶25 g/mL先增加后减少，可能因为为溶剂体积过小，CA无法彻底溶解，但溶剂体积过大，更易溶出其他的杂质达到饱和[22]，继续增大料液比不会增加溶出率，故选择料液比 1∶20 g/mL；CA含量随提取时间从40～120 min先增加后减少，CA溶出率一定时间内随着提取时间增加增加，但提取时间过长，料液长时间处于受热状态，更容易造成CA损失，固选择提取时间60 min[23]；CA含量在提取次数2次时最大，故选择提取次数两次。最佳条件为乙醇体积分数95%，料液比1∶20 g/mL，提取时间60 min，提取次数2次。

图2 醇提单因素试验结果图

活性物质含量(mg/g)计算公式:

含量=M供×C标/M对

式中M供为供试品峰面积；

C标为标准品的浓度(mg/mL)

M对为标准品峰面积

2.3 Box-Behnken响应面法优化醇提工艺

2.3.1 响应曲面试验设计及结果 依据Box-Behnken响应面试验设计原理，结合上述醇提单因素试验结果，进行因素水平设计与试验。因素水平见表2，结果见表3。

表2 醇提因素水平表

表3 醇提Box-Behnken设计与结果表

表3(续)

2.3.2 醇提模型拟合及方差分析 采用Design-expert 8.0.6软件对表2中的试验结果进行分析，得到回归方程为

Y=-51.15554+0.94402A+0.40383B+0.13185C+0.72244D-6.7×10-4AB-1.17133×10-3AC+4×10-3AD-3.17333×10-4BC-0.0197BD+2.25917×10-4CD-4.58348×10-3A2-6.60648×10-3B2-1.2384×10-4C2-0.15528D2R2=0.9158。由表3可知，模型F=10.87(P<0.0001)，表明回归模型极显著，失拟项F=2.03，P=0.2584>0.05，表明模型失拟项不显著，可用于分析试验数据。以Y为响应值时，模型的一次项影响顺序是D>B>C>A，和二次项B2、D2有极显著影响(P<0.001)，一次项D和二次项A2、C2有高度显著影响(P<0.01)，一次项B、C有显著影响(P<0.05)表明所得回归方程能较好地预测Y随各影响因子的变化。见表4。

2.3.3 醇提响应面优化及预测 经Design-expert 8.0.6软件分析得响应面图(如图3所示)，由图可见提取次数对Y值影响较大，交互项对Y值无显著影响，忽略交互作用，以Y值的回归模型的极值分析得到最优提取条件为：乙醇体积分数94.77%，提取时间60 min，提取次数2.27次，料液比1∶20.93 g/mL，Y预测值为2.5783 μg/g，综合实际情况考虑，调整最优提取条件为乙醇体积分数95%，提取时间60 min，提取次数2次，料液比1∶20 g/mL。如图3所示。

图3 4种因素对Y的响应面图

2.4 醇提优化工艺验证试验 平行称取大花紫薇3份，每份2.0 g，按所优化条件进行验证试验。结果显示Y平均值为2.5613 mg/g(RSD=1.33%，n=3)，与预测值2.5783 mg/g相比较，相对误差为1.20%，说明该模型预测性拟合度良好，所得数据有效可靠。见表5。

表5 验证试验 (n=3)

3 讨论

3.1 色谱条件 本实验经反复试验，调整甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液三者的比例，最终选用流动相甲醇(B)-乙腈(C)-0.1%磷酸水溶液(D)，梯度洗脱，分离度>1.5，达到了检测要求。大花紫薇中科罗索酸的加热回流提取最佳提取工艺为：乙醇体积分数95%，提取时间60 min，提取次数2次，料液比1∶20 g/mL。实验结果表明，最佳提取方法所得科罗索酸含量为2.5613 mg/g，拟合的模型能较为准确地预测总含量，同时也说明响应面分析法精确度高、模型预测性好。

3.2 结果分析 本试验以科罗索酸为指标成分，用Box-Benhnken响应曲面法优化大花紫薇中CA的提取工艺，经工艺验证实验证明，该提取工艺操作简单，CA的提取率高，节省溶剂且稳定性好，是应用前景较好的提取方法之一，可为后续CA的应用提供参考。

3.2 展望 科罗索酸具有显著的降血糖作用，且对身体毒副作用较小，是一种较为理想的降糖化合物，数据表明大花紫薇是一种科罗索酸的含量较高的天然药用植物，寻找在其中有效提取CA的方法是很有必要的，后续的研究可以在此文章的基础上，从药效、作用机制的角度来探讨中药资源的合理开发。