Lnc MALAT1介导OLA1在肝细胞癌中表达及分子机制

李彦宁，王建华，崔云峰，王海明，王双辉，樊 宁

原发性肝癌是全球范围内常见恶性肿瘤之一，其发病率位居我国恶性肿瘤第5位，占肿瘤相关致死性原因第2位[1-2]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占原发性肝癌病例的85%～90%[3]。目前研究报道，HCC的发生发展与病毒感染、肝硬化、过度饮酒及免疫失衡等因素密切相关[4]。尽管HCC已在诊断、治疗及预后等方面取得了巨大进展，但是每年仍有70多万病例死亡[5]，临床效果尚不能令人满意。因此，迫切需要研究发现更有效的潜在治疗靶点和预后标志物，进一步了解HCC发生发展的分子机制。

Obg样ATP酶1(Obg-like ATPase 1, OLA1)是一种高度保守ATP/GTP酶，属于翻译因子相关(TRAFAC)亚类，Obg超家族中YchF亚群。OLA1在细菌、植物和哺乳动物等多数生物体内泛表达，在细胞信号传导及机体生长发育等方面发挥着重要作用[6]。研究表明，OLA1在乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肺癌等多种恶性肿瘤中异常表达，其主要是通过调控肿瘤细胞增殖凋亡、浸润和转移等机制发挥作用[7]。但是目前在HCC中的研究罕见，因此关于OLA1在HCC发生发展的作用机制尚需进一步探讨。

1 材料与方法

1.1 OLA1基因在HCC中的表达及预后分析 GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库可对TCGA和GTEx数据库中资料进行可视化分析。本研究利用GEPIA数据库对OLA1基因与HCC信息进行交互分析，同时进行总体生存期(overall survival, OS)分析。Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/)是目前进行肿瘤相关生物学分析常用的基因芯片数据库。本研究利用Oncomine数据库的4个数据集，对OLA1基因在HCC中的表达情况进行Meta分析。

1.2 OLA1基因与HCC病例临床特征的相关性分析 Kaplan-Meier(KM) Plotter数据库(https://kmplot.com/analysis/)是一个能够对20余种恶性肿瘤进行mRNA和miRNA预后评估的在线数据库。本研究利用KM Plotter数据库分析OLA1基因(RNA-Seq Id, 29789)表达与HCC病例临床病理特征对OS和无进展生存期(progression-free survival,PFS)的影响，包括性别、TNM分期(AJCC 8版)、组织分化程度和血管侵犯。

1.3 OLA1基因上游miRNA预测及miRNA差异表达和生存分析 starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)数据库是研究非编码RNA(ncRNA)常用数据库之一。本研究利用starBase数据库筛选获得OLA1基因上游微小RNA(microRNA, miRNA)，提取 PITA、RNA22、miRmap、microT、miRanda、PicTar及TargetScan三个以上程序中预测阳性的miRNAs。进一步行相关性分析，获得与OLA1显著负相关的miRNA，并进行差异表达分析。利用KM Plotter数据库对显著差异表达miRNA进行生存分析。

1.4 miRNA相关lncRNA预测及lncRNA差异表达和生存分析 利用starBase数据库对此前已筛选获得的miRNA进行其上游长链非编码RNA(long non-coding,lncRNA)的预测筛选，设置参数：miRNA: miR-144-3p；pan-Cancer≥ 1；target: all，余为数据库默认参数。利用GEPIA数据库分析starBase数据库筛选获取的lncRNA在HCC正常样本和肿瘤样本中的表达水平，同时进行OS分析。

1.5 lncRNA、miRNA及OLA1相关性分析 利用starBase数据库进行HCC病例中lncRNA与miRNA和OLA1基因之间的相关性分析，并获取相关系数R值和P值。将上述分析结果绘制成表格进行分析。

2 结果

2.1 OLA1基因在HCC中表达及预后结果 利用Oncomine数据库对OLA1基因在HCC中的表达情况进行Meta分析，结果显示，4个研究中HCC肿瘤样本OLA1基因表达水平均较正常样本呈过表达状态，差异有统计学意义(P＜0.01)，如图1A。使用GEPIA在线工具，对TCGA和GTEx数据库中160例肝脏正常样本和369例HCC样本分析，结果显示，OLA1基因在HCC组织中明显高于正常组织，差异有统计学意义(P＜0.01)，如图1B。进一步进行预后分析表明，OLA1基因表达水平与HCC病例预后呈显著负相关(P＜0.01)，如图2。

图1 在线数据库分析OLA1基因在HCC中表达水平

图2 OLA1基因表达与HCC预后相关性分析

2.2 OLA1基因与HCC病例临床特征相关性分析结果 利用KM Plotter数据库对各个临床病理参数进行逐个分析，获得不同亚组中OLA1表达对OS及PFS的影响。分析过程中，组织学分级G4、大血管侵犯的病例数少，无法进行统计学分析。相关性分析结果表明，表达上调OLA1基因与性别、TNM分期、组织学分级和血管侵犯之间存在显著相关性，见表1。

2.3 OLA1基因上游miRNA预测与分析结果 目前研究表明，ncRNA可以在基因表达过程中发挥重要调控作用。为明确HCC发生发展过程中ncRNA是否影响OLA1基因调控作用的发挥，本研究利用starBase数据库预测可能潜在与OLA1基因结合的上游miRNA，最后获得25个miRNA。利用Cytoscape软件构建miRNA-OLA1调控网络，如图3A。获取miRNA与OLA1基因的相关系数R值和P值，如图3B。基于miRNA调控靶基因的作用机制，获得了与OLA1基因存在显著负相关的miR-144-3p。进一步分析发现，miR-144-3p在HCC组织中呈过度低表达状态，且与预后显著正相关，均具有统计学意义(P＜0.01)，如图3C和3D。

图3 miR-144-3p筛选为OLA1潜在上游miRNA

2.4 miR-144-3p上游lncRNA预测与分析结果 利用starBase数据库预测miR-144-3p上游lncRNA，共预测获得93个潜在lncRNA。利用GEPIA数据库分析93个lncRMA在HCC中的表达情况，在TCGA和GTEx两个数据库中均有统计学意义为有效lncRNA。结果显示，DUXAP8、GAS5、LINC00665和 MALAT1共 4个 lncRNA在HCC样本中较肝正常样本呈过表达状态，均具有统计学意义(P＜0.01)，如图4。本研究进一步分析了4个lncRNA在HCC中的预后价值。结果显示，DUXAP8过表达的HCC患者，其OS预后较差；而MALAT1过表达的患者，其无病生存期(DFS)预后较差，差异均有统计学意义(P＜0.05)，如图5。

图4 HCC中miR-144-3p上游lncRNA的表达分析

图5 HCC中 miR-144-3p上游lncRNA的预后分析

2.5 lncRNA与miR-144-3p和OLA1相关性分析结果 内源竞争RNA假说是近年来lncRNA领域研究的热点，其主要依据是lncRNA可以通过竞争性结合miRNA来增加mRNA的表达。因此，lncRNA与miRNA负相关且与mRNA正相关。本研究根据此理论进一步利用starBase数据库，对上述4个lncRNA与miR-144-3p和OLA1之间的关系进行相关性分析，发现DUXAP8与miR-144-3p无统计学差异，故将其去除；而MALAT1与miR-144-3p和OLA1基因关系密切。见表2。

表2 lncRNA与miR-144-3p和OLA1相关性分析

3 讨论

HCC是常见的消化道恶性肿瘤，具有起病隐匿、肿瘤异质性高、早期诊断困难和预后不良等生物学特征，5年生存率仅为12.5%[8]。我国HCC患病年龄具有年轻化趋势，给社会发展和公共身体健康带来了严重负担和威胁。因此，深入研究HCC发病的分子机制，可以为寻找有效潜在治疗靶点和发现可靠诊断预后生物标志物提供思路。研究表明，OLA1基因在结肠癌、胃癌及卵巢癌等多种恶性肿瘤中呈过表达状态，且在多种恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用[9]。但是，OLA1基因在HCC发生和发展过程的分子机制及对预后的影响尚不明确。

OLA1基因在HCC中的表达和作用已有少量报道，但是多数研究均是通过体外试验验证。为明确OLA1在HCC中的表达情况，本研究首先利用Oncomine数据库对多个数据集进行Meta分析，且利用TCGA和GTEx数据中HCC与OLA1基因相关数据进行交互验证。两种分析方法结果一致，均提示OLA1基因在HCC样本中较正常肝样本表达上调。提示OLA1基因在HCC患者机体内环境中呈表达失调状态，且可能在HCC进展过程中发挥着调控作用。生存分析表明，OLA1基因高表达HCC患者总体生存时间预后差，且具有统计学意义。进一步进行OLA与临床病理特征相关性分析，发现OLA表达水平与性别、TNM分期、组织学分级和血管侵犯之间关系密切，提示OLA1可作为HCC患者预后的分子标志物。Huang等[10]研究报道，OLA1基因通过调控肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等途径，促进HCC进展。该研究结果与本研究分析一致，表明OLA1基因确实在HCC的进展中发挥着促癌作用，但其具体机制有待进一步研究。

众所周知，ncRNA包括lncRNA、miRNA和环状RNA(circRNA)，其在机体内主要通过内源性竞争机制调控基因表达。本研究利用PITA、RNA22、miRmap、microT、miRanda、PicTar 及TargetScan共7个预测程序，预测筛选出OLA1基因上游潜在miRNA共25个。目前有研究报道，多数miRNA在HCC中通过不同机制发挥肿瘤抑制作用。Tian等[11]研究表明，miR-144-3p过表达可以通过抑制肝癌细胞增殖、菌落形成及促进细胞凋亡等方式，调控肝癌细胞生物学功能。miR-48通过靶向调控Caspase-3、Caspase-9和Bax等多种途径促进肝癌细胞凋亡，抑制HCC发生和发展[12]。miR-362-3p通过与Rab23和circMYLK相互作用，抑制肝癌细胞侵袭和转移[13]。本研究通过对筛选获取miRNA进行表达、预后和相关性分析发现，miR-144-3p在HCC样本中明显低表达，且与总体生存时间关系密切，为OLA1基因上游最佳潜在肿瘤抑制性miRNA。根据内源竞争假说，本研究推断miR-144-3p-OLA1轴上游lncRNA在HCC中可能起着促癌作用。本研究进一步对miR-144-3p-OLA1轴上游lncRNA预测，共筛选得到93个潜在lncRNA。综合对各lncRNA表达、预后及相关性分析发现，MALAT1为潜在最佳上调lncRNA。既往研究报道，MALAT1在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥促癌作用。有研究显示，MALAT1可以通过与MTOR/TCF7L2相互作用，调控HCC糖代谢，促进肿瘤进展[14]。Hou等[15]通过敲除肝癌细胞HepG2 和Huh-7中MALAT1后，发现肝癌细胞分泌VEGF-a减少，促进巨噬细胞向M1极化，间接表明MALAT1具有促进肿瘤血管形成和抑制肿瘤免疫的生物学功能。这些研究结论与本研究分析结果一致，证实lncRNA MALAT1与miR-144-3p之间为负相关，与OLA1基因为正相关关系。

综上所述，OLA1基因在HCC患者体内高表达，且OLA1基因高表达与HCC患者不良预后正相关。HCC患者中OLA1基因上游调控机制可能是OLA1通过MALAT1-miR-144-3p轴发挥调控作用。结合既往关于OLA1基因、lncRNA MALAT1和miR-144-3p在HCC中的生物学功能，本研究认为MALAT1-miR-144-3p-OLA1轴在HCC发生发展过程中发挥着重要作用。OLA1基因和miR-144-3p可以作为HCC的预后标志物和潜在免疫治疗靶点。