冬凌草甲素对膀胱癌细胞凋亡作用及其分子机制研究

赵 凡，钟尊合，王锦锐，张行军，詹江涛，陈绵川，车宪平

膀胱癌（bladder cancer, BC）是全球常见的泌尿系统恶性肿瘤，其发病率居癌症谱第十位，2022年中国新发膀胱癌病例91 800例，死亡42 900例，男性的发病率远大于女性[1]。当前，手术、化疗和放疗是膀胱癌的主要治疗方法，此外还有靶向治疗和免疫治疗[2]。尽管当前合理的综合治疗已经为患者带来不错的预后，但药物治疗并非对所有类型的膀胱癌都有效，且化疗药物的毒性及毒副作用也会带给患者不可避免的痛苦。因此，临床迫切需要有效且不良反应少的治疗方法。

冬凌草甲素是一种从中药冬凌草中提取的天然萜类化合物，对多种肿瘤具有抗肿瘤作用[3]。研究发现，冬凌草甲素对膀胱肿瘤也有显著的抗肿瘤作用，但机制仍未阐明。本研究在前期研究基础上，进一步研究冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞的抑制作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 化学试剂 冬凌草甲素（99.85%）购自上海MedChemExpress公司，溶解在1%二甲基亚砜（DMSO）溶液中。瞬时受体电位M7通道(TRPM7)、GAPDH、p-AKT、p53以及裂解的caspase-3和辣根过氧化物酶（HRP）偶联二抗的单克隆抗体购自美国Proteintech公司。

1.2 细胞培养 人膀胱癌T24细胞购自中国科学院上海细胞库研究所，在10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养。

1.3 CCK8检测冬凌草甲素作用T24细胞后的增殖变化 将2×103个T24细胞置入96孔板中，培养直到细胞融合度达75%。然后，用不同浓度的冬凌草甲素(0、3、5、7、10、15、25和35 µmol/L)处理细胞。再一次孵育24 h后，将CCK8测定液（10 µL）添加到每个孔中并孵化4 h。用酶标仪检测各孔在450 nm处的光密度(OD)值。将计算出的平均值用于构建一个细胞生长曲线。

1.4 迁移试验 将800 µL的完全培养基放入下腔室。预处理细胞（2.5×103）在含有200 µL的无血清培养基，其中含有0、1、2或3 µmol/L冬凌草甲素。在37 ℃下培养24 h后，上腔室的培养基被丢弃，细胞用4%的甲醛固定，100%甲醇渗透，并用水晶紫染色。然后，在光学显微镜下对染色细胞进行量化。

1.5 集落形成试验 细胞悬浮于12孔板中生长（0.5×103/孔）。在细胞稳定地贴壁后，弃置培养基，将细胞在含有0、1、2、3 µmol/L冬凌草甲素的培养基中连续培养2周。获得图像后记录≥50细胞的可见菌落的数量。

1.6 凋亡分析 T24细胞（3×103个细胞/孔）在6孔板中生长一夜，然后在37 ℃下孵化48 h，并含有0、1、2或3 µmol/L的冬凌草甲素。共有2×103个细胞被胰蛋白酶分散，并用2 µL annexin V和2 µL PI孵化。在黑暗中染色15 min后，用流式细胞仪对样品进行分析，并确定凋亡细胞百分比。

1.7 Western blotting检测 TRPM7、GAPDH、p-AKT、p53和裂解caspase-3抗体蛋白表达 将20 µg蛋白质装载在10%的SDS-PAGE凝胶上，在80 V的恒定电压下电泳，并电转移到PVDF膜上。使用脱脂牛奶（5%）来防止膜上的非特异性结合。随后，用一抗和二抗孵育细胞膜。化学发光法显示条带，用荧光镜成像仪扫描，然后用Image J进行量化。本研究使用的主要抗体是兔抗TRPM7、GAPDH、p-AKT、p53和裂解caspase-3抗体。

1.8 统计学分析 数据用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差表示，两组比较用t检验，多组比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冬凌草甲素抑制T24细胞增殖、迁移和集落形成 不同浓度的冬凌草甲素作用T24细胞24 h后，T24细胞的增殖率显著减弱。当用10 µmol/L或35 µmol/L冬凌草甲素作用T24细胞时，其增殖能力分别减至62.70%和0.99%（图1）。Transwell迁移试验显示，冬凌草甲素干预24 h后，迁移的细胞数量以剂量依赖性的方式减少（图2）；T24细胞的菌落形成率也显著下降（图3）。

图1 不同浓度冬凌草甲素作用T24细胞后的增殖变化

图2 不同浓度冬凌草甲素作用T24细胞后的迁移能力变化

图3 不同浓度冬凌草甲素作用T24细胞后的菌落形成能力变化

2.2 冬凌草甲素诱导T24细胞凋亡 冬凌草甲素呈浓度依赖性地触发T24细胞凋亡。冬凌草甲素处理T24细胞后，实验组的p53、裂解的caspase-3蛋白水平均高于对照组，且其表达水平变化呈浓度依赖性增加（图4）。

图4 不同浓度冬凌草甲素作用T24细胞后凋亡变化情况

2.3 冬凌草甲素通过抑制TRPM7表达灭活AKT信号通路 在冬凌草甲素处理膀胱肿瘤T24细胞后，Western blotting显示TRPM7、p-AKT的表达水平均低于对照组，且随着冬凌草甲素的浓度增加，TRPM7、p-AKT的表达水平逐渐降低，见图5。

图5 不同浓度冬凌草甲素作用T24细胞后相关蛋白变化

3 讨论

膀胱癌是泌尿系统最常见的泌尿系统恶性肿瘤，非肌肉侵袭性膀胱癌（non muscle invasive bladder cancer，NMIBC）是膀胱癌的常见亚型之一，占临床诊断病例的75%[4]。虽然NMIBC致死率很低，但其复发率高于其他类型的膀胱癌[5]。NMIBC治疗的首选方法是手术切除[6]。目前，在内镜下切除术后膀胱灌注化疗或基于卡介苗灌注的治疗是为了消除残留的微肿瘤，并降低肿瘤复发和死亡的风险[7-8]。然而，目前在膀胱癌进行化疗或基于卡介苗灌注治疗的方法尚未被证明是普遍有效的，并且30%～45%的NMIBC患者对治疗无反应[9]。此外，随之不可避免的出现局部或全局性并发症[10]。因此，迫切需要更有效的治疗方法来克服膀胱癌治疗的瓶颈。

瞬时受体电位（TRP）通道是细胞膜上的阳离子选择性离子通道，是各种功能感受器，感受各种外界刺激，参与肿瘤的发生与发展[11]。TRPM7是一个TRP通道，包含离子通道和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并在功能上控制Mg2+和Ca2+稳态[12]。在包括膀胱癌在内的各种癌症中，可见TRPM7的异常表达[13-14]。这些通道蛋白酶或通道激酶在肿瘤转化期间有助于EMTC（上皮-间质转化）激活，促进细胞浸润和入侵，并正向促进细胞生存[15-17]。此外，TRPM7的表达与癌症预后不佳相关的多种临床病理因素呈正相关[18-19]；因此，TRPM7可能成为肿瘤的可行治疗靶点或生物标志物。

尤其是沉默TRPM7可以增强对氧化应激的敏感性，增加凋亡诱导剂BAX/BCL2的比例，并有助于裂解的caspase-3的积累[20]。TRPM7还可以通过激活ERK1/2来影响细胞运动和侵袭[21]，操控致癌AKT事件，促进各种癌症的肿瘤发生、侵袭和转移[15]。因此，靶向抑制TRPM7表达，可以通过下调ERK或AKT阻止膀胱癌的发生和发展。

目前，多种药理化合物和植物制剂已被证明可以有效减弱肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，从而通过阻断TRPM7通道防止恶性肿瘤的发生[22]。waixenicin A是一种从红珊瑚中提取的天然萜类化合物，是一种TRPM7的有效抑制剂和强效的抗肿瘤剂[23]。冬凌草甲素是从冬凌草中分离出来的与waixenicin A结构类似的化合物，通过调节经典的致癌事件，对多种肿瘤具有显著的抗肿瘤能力[24-25]，影响细胞功能，如细胞增殖、迁移、入侵、凋亡和自噬，从而对癌症的致瘤特性发挥抗肿瘤作用[26-27]。然而，到目前为止，它对膀胱癌的影响尚未见报告。

本研究假设抑制TRPM7可以通过AKT信号通路促进冬凌草甲素的抗肿瘤活性，并采用试验来验证这一假设。

尽管规范的膀胱癌治疗已经为膀胱癌患者带来了较好的预后，但术后转移和复发仍然是膀胱癌治疗的主要挑战[28]。本研究探讨冬凌草甲素在膀胱肿瘤中的抗肿瘤活性，并探讨了其潜在机制。结果表明，冬凌草甲素通过降低TRPM7表达水平，显著抑制T24细胞增殖、菌落形成和迁移，并诱导细胞凋亡。

研究表明，冬凌草甲素可以有效阻碍各种肿瘤的生长[29]。但以往的研究并没有关注冬凌草甲素对膀胱癌的影响。本实验研究冬凌草甲素在膀胱癌细胞系T24中的抗增殖活性，结果显示冬凌草甲素可以显著抑制T24细胞系的增殖能力。冬凌草甲素对肿瘤细胞的抗增殖作用与诱导细胞凋亡有关。因此，本实验检测了冬凌草甲素干预后T24细胞的凋亡率。冬凌草甲素干预的T24细胞表现出强烈的凋亡，在浓度高达1 µmol/L时，T24细胞凋亡率增加到（68.62±2.31）%。p53是一种成熟的凋亡诱导剂，其激活可以增加原凋亡因子的表达，减少抗凋亡基因的表达[30]。裂解caspase-3蛋白上调在细胞内蛋白裂解和形态学特征改变中具有关键作用。本研究采用Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达，p53和裂解caspase-3的表达水平随着冬凌草甲素浓度的增加而增加,表明冬凌草甲素会触发T24 膀胱癌细胞的凋亡。这些结果表明，冬凌草甲素对T24细胞具有抗增殖作用，通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤的生长。冬凌草甲素限制了裸小鼠T24肿瘤生长的事实证实了这一发现。

TRPM7与肿瘤的生物学行为密切相关，例如持续慢性增殖、肿瘤抑制逃逸以及浸润转移的变化[31-33]。TRPM7在各种肿瘤中处于持续活化状态，包括膀胱癌[34]。此外，TRPM7表达的上调预示着肿瘤的生物学行为预后较差[34]。TRPM7沉默可能会限制膀胱癌的增殖、侵入和迁移能力。

waixenicin A是一种天然萜类化合物，是TRPM7的有效抑制剂，并对人类胃和乳腺肿瘤细胞的恶性行为具有不利影响[31]。据报道，冬凌草甲素是一种萜类化合物，与waixenicin A具有相似的功能结构[35]。因此，研究冬凌草甲素对T24细胞的作用后发现，冬凌草甲素能有效地降低TRPM7的表达水平，这与膀胱癌的抗凋亡、增殖、粘合和侵入潜力有关。之前的研究表明，TRPM7的抑制会使AKT信号事件失活，从而影响各种肿瘤癌细胞的命运[16,22]。此外，报告显示，冬凌草甲素通过灭活肺肿瘤中的AKT信号事件来减少转化细胞的恶性表型[36]。因此，本研究进一步测量了AKT的磷酸化水平，以阐明冬凌草甲素的潜在调节机制。用冬凌草甲素治疗后，T24细胞磷酸化AKT水平降低。上述发现表明，冬凌草甲素可能通过调节AKT信号通路降低TRPM7的表达，从而抑制T24细胞的生长和迁移。

综上所述，冬凌草甲素通过抑制TRMP7、失活AKT实现抗肿瘤作用。冬凌草甲素可能成为膀胱癌诊疗的新方法。