黄芪甲苷预处理对大鼠肠缺血再灌注所致肺损伤的影响及其机制

王 蕾，杨 涛，李 曼，庞申月，鲁富泰，耿立成

肠缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）是腹部大手术患者围手术期的严重并发症，能够进展为肠源性脓毒症甚至多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome, MODS），严重威胁着患者的生命健康[1]。肠I/R除影响肠组织本身之外，还能够造成远端器官的功能障碍，其中以肺脏受累最为常见[2]。本课题组前期研究证实，黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ）灌胃预处理对肠I/R所致的肠损伤具有明确的保护作用，然而AS-Ⅳ对I/R所致肺损伤的作用仍不清楚[3]。本研究拟通过建立大鼠肠I/R模型，探讨AS-Ⅳ对肠I/R所致肺损伤的影响以及相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年雄性SPF级、体质量180～220 g的SD大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 主要药物与试剂 AS-Ⅳ购自上海源叶生物科技有限公司；白细胞介素（IL）-1β和IL-18的ELISA试剂盒购自武汉Elabscience公司。兔抗NLRP3单克隆抗体、兔抗ASC单克隆抗体、兔抗caspase-1单克隆抗体、小鼠抗GAPDH单克隆抗体均购自上海Arigo公司。

1.1.3 主要仪器设备 正置光学显微镜（德国Carl Zeiss公司）；高速低温离心机（美国Thermo Fisher公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；SDSPAGE凝胶电泳系统及全自动凝胶成像-分析系统（美国Bio-Rad公司）。

1. 2 方法

1.2.1 分组与给药 将45只SD大鼠按照随机数字表法分为3组：假手术（sham）组、肠缺血再灌注（I/R）组、AS-Ⅳ预处理（AS-Ⅳ）组，每组15只。AS-Ⅳ组于造模前60 min，使用AS-Ⅳ 60 mg/kg灌胃预处理；sham组和I/R组给予等体积的生理盐水灌胃预处理。

1.2.2 模型制备 本研究已通过天津市人民医院动物伦理委员会批准（审批号：2021-SYDWLL-000190），并严格按照动物实验伦理学原则进行。大鼠于术前禁食12 h，自由饮水，参照文献[4]制备肠I/R模型。采用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）行腹腔注射，待麻醉满意后仰卧位固定于动物手术台。按照无菌操作原则，经腹正中切口，寻找并分离肠系膜上动脉（superior mesenteric artery, SMA），无创微动脉夹夹闭SMA，待SMA搏动消失且肠壁色泽变苍白时，开始肠缺血计时；缺血60 min后恢复SMA血流灌注，SMA搏动恢复且小肠组织颜色由暗红变为鲜红，表明再灌注成功。回纳血管，关闭腹腔。I/R组和AS-Ⅳ组依照上述方法建立模型，sham组仅分离SMA而不夹闭。各组均于再灌注120 min时，取肺组织进行各项指标的测定。

1.2.3 肺组织染色及病理学评分 每组取3只大鼠，取其肺组织，用10%多聚甲醛固定24 h。经石蜡包埋、切片后进行HE染色，光镜下（×100）观察肺组织病理学改变水平并进行病理学损伤评分，评分标准参考文献[5]。

1.2.4 肺组织湿/干（W/D）比值的测定 每组取3只大鼠，取其左肺上叶，滤纸吸干表面液体，电子天平精确称量肺组织的湿质量；随后将肺组织置于烘箱中80 ℃条件下鼓风干燥48 h，精准称量肺组织的干质量。肺组织W/D比值=肺组织湿质量/干质量。

1.2.5 酶标仪检测支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）/血清分子量为4 kDa的FITC标记右旋糖酐（FITC-dextran 4 kDa, FD4）比值 每组取3只大鼠，经尾静脉注射10 mg/kg的FD4。10 min后于心尖部穿刺取血，行气管切开并气管插管，使用1 mL注射器向气管内缓慢注射PBS溶液充分冲洗3次，每次0.8 mL，回收得BALF。利用酶标仪分别检测血清和BALF中的FD4浓度，并计算BALF/血清FD4浓度的比值。

1.2.6 ELISA法检测肺组织IL-1β和IL-18水平每组取3只大鼠，取适量肺组织，冰上充分匀浆，4℃静置30 min后离心10 min（4×103r/min，离心半径10 cm），收集上清。利用酶标仪采用ELISA法检测上清液中IL-1β和IL-18浓度水平，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.2.7 Western blotting法测定大鼠肺组织中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达 每组取3只大鼠，取适量肺组织，冰上充分匀浆裂解，4 ℃离心10 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度。各组蛋白样品分别加入10%浓度的SDS-PAGE凝胶泳道中电泳，湿转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入以下一抗：兔抗NLRP3单克隆抗体（稀释比1∶500）、兔抗ASC单克隆抗体（稀释比1∶1 000）、兔抗caspase-1单克隆抗体（稀释比1∶500）和兔抗GAPDH单克隆抗体（稀释比1∶2 000），4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（稀释比1∶2 000），室温孵育2 h。洗涤PVDF膜，于暗室加入ECL发光液，利用凝胶成像系统进行阳性信号检测，并用Image J软件分析蛋白条带的灰度值，计算目的蛋白条带与GAPDH条带灰度值的比值，即为目的蛋白的相对表达水平。

1.3 统计学处理 使用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AS-Ⅳ对肺组织病理学的影响 与sham组比较，I/R组中的肺泡形态结构紊乱，肺泡腔发生塌陷、融合，肺泡壁增厚，肺间质水肿，毛细血管充血，肺泡腔和肺间质存在大量炎性细胞浸润，肺组织病理学损伤评分显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，AS-Ⅳ组中的肺泡形态学结构破坏减少，水肿减轻，炎性细胞浸润减少，肺组织病理学损伤评分显著降低（P＜0.05）。见图1、表1。

图1 三组肺组织病理学变化情况比较 （HE染色，×100）

表1 三组大鼠肺组织病理性损伤评分、W/D比值和BALF/血清FD4比值的比较

2.2 AS-Ⅳ对肺组织W/D比值和BALF/血清FD4比值的影响 与sham组比较，I/R组肺组织W/D比值和BALF/血清FD4比值显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，AS-Ⅳ组肺组织W/D比值和BALF/血清FD4比值显著降低（P＜0.05）。见表1。

2.3 AS-Ⅳ对大鼠肺组织IL-1β和IL-18含量的影响 与sham组比较，I/R组IL-1β和IL-18含量显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，AS-Ⅳ组IL-1β和IL-18含量显著降低（P＜0.05）。见表2。

表2 三组大鼠肺组织IL-1β和IL-18含量的比较

2.4 AS-Ⅳ对肺组织NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达的影响 与sham组比较，I/R组NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与I/R组比较，AS-Ⅳ组NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见图2、表3。

图2 Western blotting法测定大鼠肺组织中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达情况

表3 三组大鼠肺组织NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达水平的比较

3 讨论

急性肺损伤是肠I/R最易并发的远隔脏器损伤，也是肠I/R损伤引发MODS的重要环节，探讨肠I/R所致肺损伤的治疗手段十分必要[6]。本研究通过建立肠I/R的大鼠模型，研究AS-Ⅳ对肠I/R所致肺损伤的影响及其分子机制。

黄芪作为珍贵的传统中药材，始载于《神农本草经》，在我国沿用已有千年之久。中国药典记载，药用黄芪为豆科植物蒙古黄芪或者膜荚黄芪的干燥根，AS-Ⅳ是黄芪最主要的活性单体成分，其化学本质是一种四环三萜类皂苷[7]。近期研究证实，AS-Ⅳ对多种因素导致的肺损伤具有一定的治疗作用[8-10]。因此，本研究参照前期实验条件，用60 mg/kg的AS-Ⅳ对大鼠进行灌胃预处理，观察AS-Ⅳ对肠I/R所致肺损伤的影响。结果发现，肠I/R模型组的肺组织病理学损伤评分、肺组织W/D比值和BALF/血清FD4比值均显著升高，表明大鼠肠I/R能够诱发肺组织损伤，证实动物模型构建成功；AS-Ⅳ能够显著降低肺组织病理学损伤评分、肺组织W/D比值和BALF/血清FD4比值，表明AS-Ⅳ对肠I/R所致的肺损伤具有明确的保护作用，能够减轻急性肺损伤的严重程度。

促炎细胞因子过度释放能够启动炎症级联反应，诱发炎性免疫细胞浸润，导致损伤肺血管内皮细胞和肺泡上皮诱发肺水肿，最终发生急性肺损伤，因此炎性介质过度释放被认为是肺组织损伤的重要发病机制[11]。有研究表明，肠I/R引发的肺损伤能够通过激活免疫细胞释放更多的IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α等炎性因子，从而进一步加重肺脏及全身炎症反应[12]。本研究进一步探讨AS-Ⅳ对肠I/R相关肺损伤的炎症反应的影响。结果表明，肠I/R模型的肺组织中IL-1β和IL-18的含量显著升高，AS-Ⅳ则能显著降低炎性因子IL-1β和IL-18在肺组织中的含量，提示AS-Ⅳ对肠I/R所致肺损伤的改善作用可能与其显著的抗炎作用有关。

NLRP3炎症小体在机体的炎症反应调控机制中扮演着核心角色[13]。在I/R等伤害性信号的刺激下，损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）能够被多种模式识别受体所识别，其中的胞浆内模式识别受体NLRP3通过与凋亡相关斑点样蛋白ASC相互衔接，进而募集pro-caspase-1形成巨大的蛋白复合体，即为NLRP3炎症小体，促使pro-caspase-1自我切割成熟为caspase-1，活化的caspase-1一方面切割消皮素（Gasdermin D, GSDMD）形成GSDMD-NT，后者与细胞膜上的磷脂蛋白结合，导致质膜孔的形成，诱发细胞焦亡；另一方面，caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18形成具有活性的IL-1β和IL-18，并随细胞焦亡的发生释放至胞外，引发强烈的炎症反应[14]。本研究在发现AS-Ⅳ对肠I/R相关肺损伤的改善作用与减少IL-1β和IL-18含量的基础上，进一步探讨NLRP3炎症小体在AS-Ⅳ治疗肠I/R相关肺损伤中的作用。结果发现，在I/R模型的肺组织中，NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达水平显著升高，表明NLRP3炎症小体参与肺损伤的发生与进展过程；而AS-Ⅳ能够显著下调肺组织中NLRP3、ASC和caspase-1的高表达水平，提示AS-Ⅳ可能是通过抑制NLRP3炎症小体激活来发挥对肠I/R所致肺损伤的保护作用。

综上所述，AS-Ⅳ灌胃预处理能够显著改善大鼠肠I/R所致的肺损伤，其机制可能与下调NLRP3炎症小体活化水平，减少IL-1β、IL-18等炎性因子释放，进而减轻肺部组织炎症反应有关。