基于Wnt/β-catenin 信号通路的中医药防治骨质疏松症研究进展*

金颖慧，闫国强，张俊艳，张 倩，李宝芬

（河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061000）

骨质疏松症为全身慢性代谢性疾病，主要特征是骨密度降低、骨微结构破坏，造成骨脆性增加［1］，易导致骨折。其严重的不良反应事件为发生脆性骨折，较轻的碰撞、跌倒，甚至咳嗽均可能导致骨折发生，威胁老年人的身体健康。骨密度受一系列细胞因子、信号通路的影响和控制。骨代谢过程中的信号传递调控机制的障碍为诱导骨质疏松症关键因素，对于Wnt信号通路影响骨代谢调节机制的研究日益增多，该通路分为经典与非经典两类，目前仅对前者的研究较多。中医药防治骨质疏松症日益受到重视，并突显出巨大优势。在此，以“Wnt/β-catenin 信号通路”“骨质疏松症”“中医药”为关键词，检索国内外数据库中相关文献，总结Wnt/βcatenin 信号通路对骨质疏松症的影响及中医药防治骨质疏松症的研究进展。现报道如下。

1 发病机制

骨质疏松症主要发病机制为骨代谢失衡，即骨吸收大于形成，其以破骨细胞活动占优势或成骨细胞活动不足、成骨性刺激不够等为主要致病因素［2-3］。骨系统平衡一旦被打破，会导致骨量减少、骨密度下降，引发骨质疏松。骨重建可维持骨代谢平衡，该过程包括激活、骨吸收、偶联、骨形成、休止5 个阶段［4］。成骨细胞（骨形成细胞）和破骨细胞（骨吸收细胞）在骨重建过程中起主要作用，其可成为治疗骨质疏松症的着手点。

2 Wnt/β-catenin 通路与疾病的关系

Wnt/ β -catenin 信号通路在调控细胞的增殖、分化、凋亡、存活及癌变等过程中起重要作用，这可能与其参与骨代谢有关［5］。Wnt/ β -catenin 通路主要由细胞外Wnt 配体蛋白（Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7b、Wnt8等）、细胞膜上的受体［Frizzled 家族分子和低密度脂蛋白受体5/ 6（LRP5/ 6）］、细胞质内的信号传导蛋白［β 联蛋白（β -catenin）、Dsh 蛋白（Dsh）、APC 蛋白（APC）、轴蛋白（Axin）、糖原合成激酶3β（GSK -3β）等］以及细胞核内转录因子［T 细胞因子/ 淋巴增强因子（TCF/ LEF）］等几部分组成［5］。有研究表明，Wnt 信号通路可通过调控成骨细胞及破骨细胞，引发骨改建，影响骨形成和骨代谢，进而改善骨质疏松症程度［6-8］。

成骨细胞是由成骨细胞前体衍生而来的单核细胞单位。它负责制造骨的主要蛋白和骨钙素、骨桥蛋白等Ⅰ型胶原蛋白，构成骨的有机环境；还负责骨矿化和制造酶碱性磷酸盐。研究显示，成骨细胞在控制破骨细胞形成中起重要作用［9］。骨细胞为另一种类型骨组织的细胞，主要源于成骨细胞中骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）分化，也参与骨的维持和矿化。许多不同骨骼疾病的治疗方法均通过骨细胞发挥作用。激活Wnt/ β -catenin信号通路可促进成骨细胞的增殖，且可调节成骨细胞分化的各个时期，例如Wnt3a 可通过Wnt/ β -catenin信号通路，促进BM-MSCs 向成骨细胞分化，并且在成骨诱导的早期刺激效果最明显，在成骨诱导的后期，Wnt3a对成骨诱导效果明显减弱［10］。当BM-MSCs开始向成骨方向分化时，Wnt信号通路可促使干细胞向成骨分化，即细胞形态由梭形转变为多角形［11］。而Wnt信号通路的拮抗分子，如分泌型卷曲相关蛋白（SFRP）、通路抑制剂Dickkopf -1（DKK1）等在成骨细胞分化后期表达量明显增加，可阻止Wnt 蛋白的下行传导，阻碍成骨细胞的活动，进而抑制成骨；反之，拮抗分子的失活则可导致高骨密度症［12］。LRP5 在骨代谢中起重要作用，作为Wnt受体和β-catenin 的上游基因，其激活可导致骨量增高，失活则可导致骨量减少，进而诱发骨质疏松症［13］。β -catenin 为Wnt 信号通路的关键调节因子，在细胞信号传导过程中起重要作用，当激活Wnt信号通路时，β -catenin 通过与核内转录因子（TCF/ LEF）DNA结合，改变DNA 结构启动下游靶基因的转录，促进成骨细胞的分化、增殖；β -catenin 的缺失可使成骨细胞的数量减少，破骨细胞数量增加，从而影响骨的生理功能，导致骨质疏松［14］。Wnt信号通路中的GSK-3β具有双向作用，其通过磷酸化β-catenin促进其降解进而减少其含量，抑制成骨细胞的分化增殖；同时GSK-3β可与Axin 向细胞膜移动并结合配体，磷酸化LRP5/ 6 并形成的大量蛋白质体可阻断GSK3β，促进β-catenin活动。GSK -3β 抑制剂可通过诱导成骨细胞分化及促进骨形成增加骨密度［15］。研究表明，Wnt 可直接影响前体细胞向成骨细胞分化的总过程，当成骨细胞外Wnt蛋白与细胞膜上受体LRP5/LRP6 结合后，通过与细胞质内的Dsh、GSK-3β，Axin，DKKs 等相互作用形成二聚体，升高β -catenin 水平，进而进入细胞核内，通过TCF/LEF1 影响Runx2 及Osterix 的表达，促进成骨细胞的增殖与分化［16-19］。

Wnt/β-catenin 信号通路激活后可调控破骨细胞的表达，对其生成、分化过程具有重要的影响［20-21］。破骨细胞是由骨髓巨噬细胞在关键细胞因子、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、核因子（NF-κB）配体受体激活因子（RANKL）的存在下产生的［22］，为致死性分化的髓样多核破骨细胞前体，其转化可消除矿化骨环境。破骨细胞前体在血液中流动，由这些前体的合成产生骨髓和成体破骨细胞。在骨吸收过程中，破骨细胞附着于骨，并在其细胞质的大致圆形延伸中与骨基质形成密封，在这些密封区域内，破骨细胞形成皱褶的边界膜。这种封闭和分泌意味着骨基质降解，骨矿物质溶解，可保护邻近细胞免受盐酸伤害。Wnt/ β -catenin 信号通路主要的配体Wnt3a 与破骨细胞具有密切关系。Wnt3a通过与破骨细胞表面的卷曲蛋白（Frz）和LRP5/ LRP6复合物结合，激活Wnt 信号通路，促进细胞内的Axin-APC -GSK -3β 复合体形成，导致GSK -3β 无法磷酸化β -catenin，当后者在破骨细胞内聚集到一定浓度后，就会进入细胞核内，启动基因转录而发挥作用［23］，在任何状态下，破骨细胞中β-catenin的失活均能增加破骨细胞的数量和骨吸收，导致骨量减少［24］。成骨细胞内Wnt信号改变会引起其分化，一小部分可能由破骨细胞功能改变或RANKL 信号通路改变引起［23］。而成骨细胞或其他细胞产生的Wnts 也会影响破骨细胞功能。如成骨细胞来源的Wnt5a 可增强破骨细胞分化［25］。但有相关文献发现，人体即便在缺少骨保护素（OPG）的条件下，Wnt系统依然具有骨保护的作用［24］。

3 中医病解及中药点评

3.1 中医病解

骨质疏松症属中医“骨痿”“骨痹”“骨枯”“骨极”范畴。古文中也有“历节”“骨肉疏薄”等相似记载［26］。中医理论认为，肾为先天之本，主骨，滋养骨骼，《素问·六节脏象论》曰“肾者……封藏之本……其充在骨”，肾精充足骨髓得养，肾精不足则骨痿无力。《灵枢·本脏》有论述“经脉者，所以行血气而营阴阳，濡筋骨，利关节者也”，瘀血阻滞，气血不能濡养骨骼，则关节不利。骨质疏松症病位虽在骨骼，但存在脏腑失调，肾脏及脾胃功能失司，病因病机有虚有实，多以虚为主，气虚及肾气不足为根本，脾胃虚损、脉络瘀阻是发病的重要因素。相关文献表明，肾虚是原发性骨质疏松症发生发展的重要病机。而补益药可改善患者的肾阴虚、肾阳虚症状，有补气血阴阳功效，以助患者补阳滋阴，调和气血，益气健脾［27］。

3.2 中药点评

近年来，许多经典中药方，如左归丸［28］、益骨汤［29］、壮骨止痛方［30］等均被证实具有上调Wnt/ β -catenin 通路表达、促进BMSCs 成骨分化、增加骨密度的作用。中药复方［31］组成以滋补肝肾类淫羊藿、补骨脂、骨碎补等为主，配以熟地黄、白芍等补血药，或黄芪等补气药等加减而成。大部分上述中药被证实可通过调控Wnt 信号通路或下游靶基因表达促进骨形成和骨矿化，故挑选其中应用频率较高的5种总结如下。

熟地黄：性温，味甘，功效长于补。《本草纲目》中记载熟地黄“填骨髓，长肌肉，生精血，补五脏、内伤不足”。现代药理学研究表明，熟地黄含梓醇、地黄苷（A，B，D 等）、地黄素、氨基酸、糖类等成分，具有抗氧化、抗癌、抗衰老、影响骨代谢等作用［32-33］。熟地黄可促进骨形成，抑制骨破坏，延缓骨量丢失，促进骨系统平衡，进而防治骨质疏松症。临床研究发现六味地黄丸联合唑来膦酸治疗绝经后骨质疏松症，可通过降低血清中Ⅰ型原胶原氨基端前肽（PINP）、β-胶原降解产物（β-CTX）、碱性磷酸酶（ALP）及骨钙素（BGP）的水平，进而使腰椎1-4、全髋关节骨和左侧股骨颈部位的骨密度增加，缓解患者的骨质疏松症症状［34］。另有研究表明，右归丸联合阿仑膦酸钠治疗肾阳虚证型的绝经后骨质疏松症，可在一定程度上改善骨密度并缓解患者因骨质疏松症导致的腰背部疼痛，缓解其疲劳症状［35］。熟地黄在中药复方中多作为君药发挥抗骨质疏松的作用。研究发现，地黄水提物治疗去卵巢骨质疏松症模型大鼠8周后，实验大鼠的股骨及腰椎骨密度均显著增加，且不影响其雌激素水平［36］。欧莉等［37］研究表明，熟地黄配伍黄芪能明显升高Wnt2、LRP5 及β -catenin mRNA 的表达水平，说明熟地黄-黄芪可能通过激活Wnt/ LRP/ β -catenin 信号通路，抑制β -catenin的降解，使β -catenin 稳定积聚于细胞质中，进而促进成骨细胞的增殖分化，调节骨代谢。

淫羊藿：性温，味辛、甘，长于壮肾阳。《神农本草经》云：“淫羊藿主阴痿绝伤，益气力，强志。”《本草纲目》指出，淫羊藿具有“强心力、坚筋骨、益精气、实腰膝”功效。研究表明，淫羊藿具有雌激素样作用，无毒副作用，口服后产生的活性代谢产物能直接刺激BM-MSCs的增殖，并诱导其向成骨细胞方向分化，从而改善骨质疏松［38-40］。临床运用淫羊藿总黄酮治疗老年骨质疏松性桡骨远端骨折，可有效缩短骨折愈合时间，促进腕关节功能恢复，改善骨质疏松效果明显［41］。且淫羊藿可有效增加患者的骨密度，缓解腰背疼痛程度，对骨质疏松症疗效确切［42］。淫羊藿总黄酮为淫羊藿的主要有效成分，具有提高BM -MSCs 向成骨分化的能力以及抑制破骨细胞活性和破骨细胞生成的双重活性，可防治骨质疏松症［43-45］；淫羊藿素对大鼠BM-MSCs 的增殖效果具有浓度依赖性［46］；淫羊藿苷通过ERα -Wnt/ β -catenin 通路促进BMSCs 向成骨分化，促进骨生成，并可利用ERα 相关的OPG/RANKL/RANK 系统，抑制破骨细胞生成，进而抑制骨吸收［47］。李磊等［48］研究发现，淫羊藿苷可诱导MSCs 向成骨细胞分化，也可通过促进Wnt3a相关基因和蛋白的表达促进MSCs向成骨细胞分化。还发现，淫羊藿苷能提高ALP 活性，促进钙化结节的形成，从而促进BMSCs 向成骨细胞分化。进一步研究表明，淫羊藿可明显上调成骨分化基因（Runx2，osteopotin，DLX5，osteocalcin，collagen type I，ERα）以及Wnt信号通路相关基因（β-catenin，Lef1，TCF7，c-jun，c-myc，cyclin D）的表达，但该促进作用可被Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂DKK1抑制［49］。可见，淫羊藿可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路防治骨质疏松症。

黄芪：味甘，性微温，归脾、肺二经，补益力较强，且有直接补肾气的作用，《本草纲目》第十二卷草部一中记载“黄芪，气味甘，微温，无毒。主治补虚，小儿百病，又补丈夫虚损，五劳羸瘦，益气，利阴气。主虚喘，肾衰耳聋”［50］。《汤液本草》中指出，黄芪“治伤寒尺脉不至，又补肾脏元气，为里药，是上中下内外三焦之药”，明确其“补肾脏元气”［51］。《日华子本草》中记载黄芪具有“助气，壮筋骨”功效［52］。临床运用黄芪可很好地缓解患者的腰腿疼痛、麻木无力等骨质疏松症状，其组方能抑制破骨细胞，减轻骨丢失程度，从而发挥抑制骨组织的吸收和增加骨量的作用［53］。黄芪主成分为黄酮类、黄芪多糖，其具有提升免疫力、抗病毒、抗菌、保护心脑血管的重要作用，且在治疗骨质疏松症方面疗效明显。黄芪多糖可通过促进成骨细胞MC-3T3-E1的增殖发挥防治骨质疏松症的作用［54］。黄芪可提高性激素水平及胃肠消化与吸收功能，并可促进钙、磷、镁等众多微量元素的吸收，促使骨量增多及骨密度升高［55］。此外，骨质疏松症以黄芪治疗，患者腰椎和股骨骨密度值会随治疗时间延长而显著升高，肾虚症的评分呈明显下降趋势，症状改善明显。大量研究证实，黄芪及其复方是通过Wnt/β -catenin 信号通路促进成骨细胞的增殖、矿化和表达，从而发挥防治骨质疏松症的作用。黄芪甲苷通过调节FoxO3a/ Wnt2/ β -catenin 通路，升高β -catenin 和Wnt2 蛋白表达水平，抑制FoxO3a 蛋白表达水平，可有效缓解氧化应激介导的去卵巢大鼠的骨质疏松症［56］。欧莉等［57］研究发现，黄芪注射液联合摩擦步训练可降低绝经期骨质疏松症患者血清ALP，BGP 含量及血清中白细胞介素（IL）-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量，升高IL-10及骨密度，对绝经期骨质疏松症疗效确切。

骨碎补：味苦，性温，归肝、肾经，有坚肾、补肾强骨功效。骨碎补始载于《本草拾遗》，清朝《本草述》中记载骨碎补“可治腰痛行痹”。骨碎补可抑制骨吸收相关的OPG/RANKL/RANK 通路、CTSK信号通路中的调控蛋白，或促进与骨形成相关的Wnt/ β -catenin 通路和BMP 通路中调控蛋白的合成和释放，改善骨代谢不平衡，从而防治骨质疏松症。骨碎补抗骨质疏松症的主成分为总黄酮，其活性单体成分含量较高的为柚皮苷及新北美圣草苷。实验研究发现，骨碎补总黄酮促进BMSCs 成骨分化早期β -catenin、LEF -1、cycline D 的mRNA 表达，抑制BMSCs 成骨分化晚期β -catenin、LEF -1、cycline D 的mRNA 表达，表明此过程中Wnt/β -catenin 信号通路可能主要参与BMSCs 成骨早期分化［58］。柚皮苷可通过Wnt/β-catenin 信号通路抑制人脂肪源性间充质干细胞（hADMSCs）因氧化反应导致的成骨分化［59］。研究发现，柚皮苷可通过调节Akt 和AMPK 激活β -catenin，促进β -catenin 的mRNA 和蛋白表达，并促进UMR-106 细胞中β-catenin 的Ser552磷酸化，进而激活LEF，TCF 转录因子，说明柚皮苷可通过影响Wnt/β-catenin 信号通路促进去卵巢骨质疏松症模型小鼠成骨细胞的形成［60］。另有研究报道，柚皮苷能有效地抗去卵巢骨质疏松症，促进BMSCs 的增殖和分化，增加BGP 的表达，并增加骨密度、增大骨体积和小梁厚度，可有效逆转卵巢切除术引起的大鼠骨质疏松症［61］。但有研究表明，骨碎补中另一抗骨质疏松症的活性成分新北美圣草苷在MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化方面优于柚皮苷，其可促进ALP 活性及上调Runx2、COLI 和OCN 的表达，可成为治疗骨质疏松症的候选药物［62］。目前，新北美圣草苷抗骨质疏松症的研究尚少，柚皮苷抗骨质疏松症实验多限于去势骨质疏松症模型，表明骨碎补抗骨质疏松症的活性成分还需进一步研究。

补骨脂：味辛、苦、性温，入脾、肾二经，补肾阳，固肾气。《本草经疏》云“补骨脂，能暖水土…壮火益土之要药也”。《药性论》记载其能“治男子腰痛、膝冷…腹中冷”。《惠民和剂局方》中记载“补骨脂丸主治肾虚阳痿证”。研究表明，补骨脂主要成分补骨脂素可促进成骨细胞分化成熟，并可调控免疫功能，抑制破骨细胞分化及骨吸收［63］。治疗骨质疏松常用临床组方中常含补骨脂，可补肾助阳，强筋健骨，增加骨密度［64］。如以青娥丸（补骨脂、杜仲、胡桃、蒜）连续治疗绝经后骨质疏松6个月，发现其可能通过下调DKK1 的表达及增加β -catenin 蛋白表达水平，提高Wnt/ β -catenin 信号通路活性，进而促进成骨细胞的骨形成，从而增加骨密度［65］。DKK1 作为阻断Wnt/ β -catenin 信号通路的抑制剂，可使Wnt3a、LRP5和下游的β-catenin显著降低，使用较高浓度的补骨脂酚或补骨脂二氢黄酮处理后，Wnt3a，LRP5 和β -catenin 的表达显著升高，且呈剂量依赖性，补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮具有雌激素样作用，促进成骨细胞分化［66］，表明补骨脂酚和补骨脂二氢黄酮可能通过上调Wnt/β-catenin 信号通路来诱导成骨细胞的分化。

4 小结与展望

目前临床治疗骨质疏松症的主要药物有雌激素类、降钙素、双膦酸盐类、钙剂和维生素类、甲状旁腺激素、锶盐、雷诺昔芬、氟化物及硬化蛋白抗体等，可通过抑制破骨细胞的破骨作用，促进成骨细胞的成骨作用，达到骨代谢正平衡，治疗骨质疏松，但长期使用有一定风险，故临床应用受限制［67］。传统中医学采用整体观，辨证论治疗，如《中国老年骨质疏松症诊疗指南》中推荐的龙牡壮骨颗粒、仙灵骨葆胶囊和强骨胶囊等，治疗骨质疏松均有一定效果。查阅中医药防治骨质疏松症的相关文献资料，发现熟地黄、淫羊藿、黄芪、骨碎补、补骨脂等均可通过调控Wnt/β-catenin 等信号通路促进成骨细胞分化，促进骨形成，增加骨密度。目前正处于临床研究中的新药DKK1抗体，可通过阻止溶骨性病变来治疗骨质疏松，增加骨形成［68］。而研究已表明补骨脂可降低DKK1 的表达及增加β -catenin 蛋白表达水平，提高Wnt/β-catenin 信号通路活性，进而促进成骨细胞的骨形成，从而增加骨密度［69］。目前临床用于治疗骨质疏松症的药物种类繁多，尚未发现可根治此类疾病的特效药物，筛选防治骨质疏松症的安全有效药物迫在眉睫。为此，深入对中医药防治骨质疏松症的研究，可为开发出治疗骨质疏松症的中药特效药提供数据基础。