尖海龙共附生真菌Talaromyces amestolkiae 次生代谢产物的研究

雷力荣，金梦莹，郭大乐，邓 赟

（成都中医药大学，四川 成都 611137）

海洋中药是传统中药组成的一部分，其药性以寒、凉、平为主，药味以咸、甘为主，常归为肝经，以沉降为主。海洋中药多具有清热解毒、消肿止痛、软坚散结、化痰止咳的功效，还有补虚作用，包括滋阴补血、补气助阳［1］。海洋共附生真菌与宿主共生互利，协同进化，对于维护宿主正常的生理功能有重要的作用。同时海洋资源丰富，特殊环境拥有特别的价值，能从中发现活性化合物。尖海龙是海龙的基原之一，具有温肾壮阳、散结消肿的功效，用于肾阳不足、阳痿遗精、癓瘕积聚、瘰疬痰核、跌补损伤［2］。Talaromycesamestolkiae属于真菌门子囊菌亚门不整子囊纲散囊目发菌科篮状菌属，其次生代谢产物研究较少，主要含有杂萜、聚酮、香豆素、吡喃酮、苯并呋喃等化合物，具有抗炎、抗菌等活性［3-6］。课题组前期对尖海龙共附生真菌Talaromycesamestolkiae次生代谢产物进行研究，从中分离得到9 个化合物［7］。本研究继续深入，得到10 个化合物，其中化合物1 为新的天然产物，化合物3～5、8～10 为首次从该菌中分离。

1 材料

Q Exactive UHMR 复合四极杆-轨道阱质谱仪（美国赛默飞世尔公司）； Bruker Bruker-Ascend-700-MHz 核磁共振仪、Bruker Bruker-Ascend-600-MHz 核磁共振仪（德国Bruker 公司）； NP7000 半制备高效液相色谱仪、NU3000 紫外检测器（江苏汉邦科技股份有限公司）； SL302N 电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）； 100-A 自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂有限公司）； DZF 真空干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）； DF-90多功能暗箱式紫外透射仪（上海宝山顾村电光仪器厂）； ChromCore PFP 色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm）［纳谱分析技术（苏州）有限公司］； Pack ODS-A 色谱柱 （250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC 公司）； MCI （75～150 μm，日本三菱公司）；Sephadex LH-20 （美国GE 公司）； 柱层析硅胶（200～300 目）、薄层层析硅胶板（5 cm×10 cm）（青岛海洋化工有限公司）。三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、甲醇（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）。葡萄糖（成都市科隆化学品有限公司）； 蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）； 酵母提取粉（北京奥博星生物技术有限责任公司）； 磷酸二氢钠（北京索莱宝科技有限公司）；琼脂（上海盛思生化科技有限公司）。

尖海龙于2018 年9 月采集于海南省陵水黎族自治县，由成都中医药大学王光志副教授鉴定为尖海龙SyngnathusacusLinnaeus。

2 方法

2.1 菌种的获得 从尖海龙中分离得到一株内生菌，菌落一开始呈黄色，1 周后慢慢变成灰绿色，在M1 培养基（葡萄糖10 g／L、蛋白胨2 g／L、酵母提取粉1 g／L、磷酸二氢钠1 g／L、琼脂15 ～20 g／L）培养1 周后，菌落直径为1 ～2 cm，表面粗糙，边界呈规则圆状，中间凸起，背部中间为黄色，周围为白色，无凸起［8］，见图1。Talaromyces amestolkiae菌种由生工生物工程（上海）股份有限公司鉴定完成（GenBank 登录号DQ513513，序列号MH856395.1），现保存于成都中医药大学药学院生化制药实验室。

2.2 菌种的扩培 将获得的菌种接种Talaromyces amestolkiae接种于M1 培养基中（250 mL 锥形瓶，每瓶100 mL 培养基），30 ℃下120 r／min 振荡培养得到发酵液，吸取5 mL 至糙米固体培养基［9］（绿糙米50 g、纯水50 mL、5%人造海水、蛋白胨2 g）中，共180 瓶，室温下静态发酵30 d。

3 提取与分离

将发酵瓶中的发酵物用筷子搅拌疏松，加入甲醇没过发酵物，浸泡1 d，取出发酵物置于烧杯中，超声处理20 min，倒入带有开关阀门的铁桶中，盖上盖子，浸泡2 d，收集滤液，取出发酵物放于烧杯中，加入甲醇，重复上述操作。将2 次收集的滤液合并浓缩至流浸膏状态，加水活化，再加入等量乙酸乙酯，萃取3 次，得到浸膏65 g。浸膏（65 g）经硅胶柱，以石油醚-丙酮（100 ∶0 ～1 ∶9）梯度洗脱，TLC 检识合并，得到Fr.1 ～Fr.27。Fr.12 经Sephdex LH-20 凝胶柱，以三氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脱，TLC 检识合并，得到Fr.12-1 ～Fr.12-4。Fr.12-1 经制备HPLC 纯化，以90%甲醇洗脱，得到化合物1 （tR＝12.5 min，3.42 mg）。Fr.12-2 经制备HPLC 纯化，以60%甲醇洗脱，得到化合物2（tR＝14.5 min，13.6 mg）。Fr.20 经Sephdex LH-20凝胶柱，以三氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脱，TLC 检识合并，得到Fr.20-1 ～Fr.20-14。Fr.20-5 经中压C18柱，以甲醇-水（10 ∶90 ～90 ∶10）梯度洗脱，得到Fr.20-5-1～Fr.20-5-8。Fr.20-5-5 经制备HPLC纯化，以43%甲醇洗脱，得到化合物3 （tR＝39.0 min，10.72 mg）。Fr.20-6 经中压MCI 柱，以甲醇-水（20 ∶80～90 ∶10）梯度洗脱，得到Fr.20-6-1 ～Fr.20-6-14。Fr.20-6-2 经制备HPLC 纯化，以13%甲醇洗脱，得到化合物4 （tR＝39.0 min，9.84 mg）。Fr.20-6-5～Fr.20-6-10 合并，经硅胶柱，得到Fr.20-6-5-1 ～Fr.20-6-5-22。Fr.20-6-5-7 经制备HPLC 纯化，以甲醇洗脱，得到化合物5 （tR＝15.9 min，1.8 mg）。Fr.21 经Sephdex LH-20 凝胶柱，以三氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脱，TLC 检识合并，得到Fr.21-1～Fr.21-19。Fr.21-5 经制备HPLC纯化，以45%甲醇洗脱，得到化合物6 （tR＝21.0 min，1 mg）。Fr.21-6 经中压C18柱，以甲醇-水（70 ∶30 ～90 ∶10）梯度洗脱，得到Fr.21-6-1 ～Fr.21-6-7。Fr.21-6-1 与 Fr.21-6-2 合并，经Sephdex LH-20 凝胶柱，以甲醇洗脱，TLC 检识合并，得到Fr.21-6-1-1～Fr.21-6-1-9。Fr.21-6-1-3 经制备HPLC 纯化，以45%甲醇洗脱，得到化合物7（tR＝20.0 min，11.11 mg）。Fr.21-6-1-7 经制备HPLC 纯化，以50% 甲醇洗脱，得到化合物8（tR＝17.0 min，1.18 mg）、9 （tR＝26.0 min，1.11 mg）。Fr.23 经Sephdex LH-20 凝胶柱，以三氯甲烷-甲醇 （1 ∶ 1）洗脱，TLC 检识合并，得到Fr.23-1～Fr.23-19。Fr.23-10 经制备HPLC 纯化，以27%甲醇洗脱，得到化合物10 （tR＝27.0 min，8 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色固体。1H-NMR （700 MHz，CD3OD）δ：7.48 （1H，s，H-3），7.29 （1H，dd，J＝8.5，2.5 Hz，H-5），7.18 （1H，dd，J＝8.5，1.0 Hz，H-6），4.97 （1H，m，H-1′），4.85（1H，m，H-1′），4.57 （1H，m，H-2′），4.49（1H，m，H-2′），1.46 （9H，s，H-4′），1.33（9H，s，H-6′）；13C-NMR （175 MHz，CD3OD）δ：149.7 （ C-4），148.8 （ C-2），140.6 （ C-1），126.2 （C-6），125.8 （C-3），120.6 （C-5），71.7（C-2′），38.1 （C-1′），36.2 （C-3′），35.9 （C-5′），32.2 （C-4′），31.2 （C-6′）。以上数据与文献［9］报道基本一致，故鉴定为2，4-bis （1，1-dimethylethyl）benzeneethanol。

化合物2：棕色油状物，ESI-MSm／z：249［M＋H］＋。1H-NMR （700 MHz，CD3OD）δ：7.46（1H，dd，J＝8.4，7.4 Hz，H-6），6.85 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），6.79 （1H，d，J＝7.4 Hz，H-5），4.62 （1H，m，H-3），2.91 ～3.05 （2H，m，H-4），2.60 （2H，t，J＝7.0 Hz，H-3′），2.17 （3H，s，H-5′），1.83 （2H，m，H-1′），1.75 （ 2H，m，H-2′）；13C-NMR （ 175 MHz，CD3OD）δ：211.2 （C-4′），171.3 （C-1），163.1（C-8），141.4 （C-10），137.3 （C-6），119.2 （C-5），116.6 （C-7），109.3 （C-9），81.0 （C-3），43.5 （C-3′），34.9 （C-4），33.5 （C-1′），29.7（C-5′），20.0 （C-2′）。以上数据与文献［10］报道基本一致，故鉴定为aspergillumarins A。

化合物3：无色油状，HR-ESI-MSm／z：267［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：7.56（1H，dd，H-6），7.06 （1H，d，J＝7.4 Hz，H-5），6.92 （1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），4.62 （1H，d，J＝7.3 Hz，H-4），4.43 （1H，m，H-3），3.74（1H，m，H-4′），1.87 （2H，m，H-1′），1.68（2H，m，H-2′），1.47 （2H，m，H-3′），1.16（3H，d，J＝6.2 Hz，H-5′）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：170.2 （C-1），162.9 （C-8），144.2（C-4a），137.8 （C-6），117.9 （C-5），117.8 （C-7），108.0 （C-8a），85.2 （C-3），68.3 （C-4），68.1 （C-4′），39.8 （C-3′），32.8 （C-1′），23.5（C-5′），22.4 （C-2′）。以上数据与文献［11］报道基本一致，故鉴定为peniciisocoumarins H。

化合物 4：棕色粉末，ESI-MSm／z：233［M-H］-。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：6.61（1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），6.59 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-6），6.02 （1H，s，H-3），4.18 （1H，m，H-2），2.67 （3H，s，-CH3），2.61 （2H，m，H-1），1.24 （3H，d，J＝6.2 Hz，-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：182.4 （C-4），167.5 （C-2），163.6 （C-7），161.9 （C-9），144.1 （C-5），118.5 （ C-3），116.2 （ C-10），112.9 （ C-6），102.1 （C-8），66.8 （C-2），44.6 （C-1），23.9（-CH3），23.6 （-CH3）。以上数据与文献 ［12］报道基本一致，故鉴定为2- （2-hydroxypropyl）-5-methyl-7-hydroxychromone。

化合物 5：黄色固体，ESI-MSm／z：314［M＋H］＋。1H-NMR （700 MHz，CD3OD）δ：7.95（1H，s，H-2′），6.83 （1H，d，J＝2.1 Hz，H-7），6.76 （1H，dq，J＝7.0，15.4 Hz，H-2″），6.74 （1H，d，J＝1.6 Hz，H-5），6.30 （1H，s，H-3），6.26 （1H，dq，J＝1.4，15.4 Hz，H-1″），6.20 （1H，s，H-5″），3.81 （3H，s，H-8），1.94（3H，dd，J＝7.0，1.4 Hz，H-3″）；13C-NMR （175 MHz，CD3OD）δ：180.3 （C-4′），172.8 （C-1），165.2 （ C-6′），162.9 （ C-6），157.6 （ C-2′），157.0 （ C-4），138.6 （ C-2″），130.7 （ C-7a），127.3 （C-3a），124.6 （C-3′），124.3 （ C-1″），113.6 （ C-5′），106.2 （ C-5），103.4 （ C-7），76.4 （C-3），56.7 （C-8），19.0 （C-3″）。以上数据与文献 ［13］报道基本一致，故鉴定为6-demethylvermistatin。

化合物6：无色油状物，ESI-MSm／z：265［M＋H］＋。1H-NMR （700 MHz，CD3OD）δ：7.54（1H，dd，J＝8.5，7.5 Hz，H-6），7.06 （1H，d，J＝8.5 Hz，H-7），6.91 （1H，d，J＝7.7 Hz，H-5），4.44 （ 1H，m，H-3 ），3.90 （ 3H，s，-OCH3），3.75 （1H，m，H-4′），2.98 （1H，dd，J＝16.8，3.5 Hz，H-4），2.91 （1H，dd，J＝16.1，11.9 Hz，H-4），1.83 （1H，m，H-1′），1.72 （1H，m，H-1′），1.59 （2H，m，H-2′），1.49 （2H，m，H-3′），1.17 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-5′）；13C-NMR （175 MHz，CD3OD）δ：165.2（C-1），162.2 （C-8），143.6 （C-4a），136.1 （C-6），120.4 （C-5），114.0 （C-8a），111.9 （C-7），79.5 （C-3），68.1 （C-4′），56.2 （-OCH3），39.6（C-3′），35.5 （C-1′），34.7 （C-4），23.3 （C-5′），22.1 （C-2′）。以上数据与文献［14］报道基本一致，故鉴定为penicimarin B。

化合物 7：棕色油状，ESI-MSm／z：281［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ：7.13（1H，d，J＝8.2 Hz，H-6），6.87 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-5），4.42 （1H，m，H-3），3.96 （3H，s，-OCH3），3.82 （1H，m，H-4′），2.86 （1H，dd，J＝15.9，11.2 Hz，H-4），2.81 （1H，dd，J＝16.0，3.2 Hz，H-4），1.86 （1H，m，H-1′），1.70 （1H，m，H-1′），1.60 （2H，m，H-2′），1.50 （2H，m，H-3′），1.20 （3H，d，J＝6.2 Hz，H-5′）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3）δ：162.8 （C-1），149.0 （C-7），148.6 （C-8），132.2 （C-4a），123.1 （ C-5），120.5 （ C-6），117.5 （ C-8a），78.8 （C-3），68.0 （C-4′），62.5 （-OCH3），39.0（C-3′），34.8 （C-1′），33.7 （C-4），23.7 （C-5′），21.4 （C-2′）。以上数据与文献［14］报道基本一致，故鉴定为penicimarin C。

化合物 8：无色油状，ESI-MSm／z：207［M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：6.42（1H，d，J＝2.2 Hz，H-7），6.28 （1H，d，J＝2.2 Hz，H-5），6.20 （1H，s，H-4），3.86 （3H，s，6-OCH3），2.17 （3H，d，J＝0.9 Hz，3-CH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：167.6 （C-1），165.5 （ C-6），162.8 （ C-8），156.5 （ C-3），144.4 （C-4a），105.4 （C-4），104.4 （C-8a），101.9 （C-5），100.2 （C-7），56.7 （6-OCH3），19.6 （C-9）。以上数据与文献［15］报道基本一致，故 鉴 定 为8-hydroxy-6-methoxy-3-methylisocoumarin。

化合物9：白色固体，HR-ESI-MSm／z：221［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：6.48（1H，d，J＝2.4 Hz，H-5），6.46 （1H，d，J＝2.4 Hz，H-7），3.88 （3H，s，-OCH3），2.24（3H，s，H-9），2.06 （3H，s，H-10）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：166.6 （C-1），165.3 （C-6），162.1 （C-8），151.6 （C-3），144.6 （C-4），108.7 （C-4a），102.0 （C-8a），101.6 （C-5），99.2 （C-7），56.2 （-OCH3），17.1 （C-9），12.7（C-10）。以上数据与文献［16］报道基本一致，故鉴定为polygonolide。

化合物10：棕色油状，HR-ESI-MSm／z：234［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.16（1H，s，H-8），8.15 （1H，s，H-2），3.56 （2H，s，H-β），1.96 （3H，s，H-δ），1.82 （6H，s，H-β′）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：208.5（C-γ），157.6 （C-6），153.1 （C-2），151.4 （C-4），141.6 （C-8），121.4 （C-5），59.3 （C-α），51.8 （C-β），31.4 （C-δ），28.2 （C-β′）。以上数据与参考文献［17］报道基本一致，故鉴定为灵芝嘌呤。

4 讨论

本研究对尖海龙共附生真菌Talaromyces amestolkiae固体发酵产物进行分离纯化，共得到10个化合物。其中化合物1 为新的天然产物，化合物2～4、6～9 为香豆素类，区别在于取代基不同，化合物5 为聚酮类，化合物10 为含氮化合物。除化合物2、6～7 外，其余化合物均为首次从中分离得到。经查阅文献发现，化合物2 表现出α-葡萄糖苷酶抑制作用，IC50值为38.1 μmol／L［6］。化合物3对HelicoverpaarmigeraHubner 初孵幼虫有生长抑制作用［11］。化合物5 对PANC-1 细胞系具有一定的细胞毒性［18］。化合物6 ～7 对Candidaalbicans、Staphylococcusepidermidis、Bacillussubtilis、Escherichia coli有抑菌作用，MIC 值在50～100 μg／mL 之间［19］。化合物 8 对Bacillussubtilis、Agrobacterium tumefaciens、Xanthomonasvesicatoria有一定的抑制作用，MIC 值分别为25、75、25 μg／mL［20］。化合物9 有一定的抗炎作用［21］。本研究丰富了Talaromycesamestolkiae次生代谢产物的种类，为其产生的活性物质研究提供参考，也为开发海洋中药的次生代谢产物提供研究基础。