脑卒中铁死亡发生机制及针刺干预研究进展*

陈瑞雪,易丽贞,黄麟荇,黄慧源,绽晟,岳增辉

湖南中医药大学 湖南 长沙 410208

在医疗水平日益发展的今天,脑卒中仍然是全球致死率较高的疾病之一,严重危害人类的健康。据现有资料显示,2019年,脑卒中共造成655万人死亡,且当年全球约有1.01亿人发生脑卒中[1]。脑卒中所带来的后遗症包括失语、偏瘫、吞咽困难、肢体痉挛及功能障碍等[2],也是当今医学界的一大难题,治疗所需要的费用是脑卒中患者家庭沉重的负担。2012年,Dixon等[3]首次提出了铁死亡的概念,直至今日,铁死亡成为医学众多领域中疾病治疗的新靶标[4]。在中枢神经系统疾病的相关研究中,铁死亡已经被证明具有重大意义[5]。

针刺治疗是一种非常具有代表性的中医治疗方式。近年来,针刺治疗在脑卒中相关疾病中的疗效日益凸显,被广泛认为是促进脑卒中康复的潜在有效治疗方式[6]。为更加系统地了解针刺是如何在脑卒中相关铁死亡中发挥干预作用,找到治疗脑卒中的新思路,笔者将近10年相关的文献进行了整理,希望可以为针刺治疗脑卒中提供更多依据。

1 铁死亡的概念及主要特征

铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡方式,不同于以往的细胞凋亡、焦亡、坏死及自噬。从生物化学方面而言,铁死亡的生物能特征主要是铁的积累和脂质过氧化[7],具体表现为过量的游离Fe2+与线粒体氧化呼吸产物过氧化氢发生Fenton反应致使活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量增多,抑制了谷胱甘肽(glutathione,GSH)合成及谷胱甘肽过氧化物酶4(recombinant glutathione peroxidase 4,GPX4)活性,导致抗氧化系统受损,氧化还原失衡,毒性脂质过氧化物大量沉积,进而促使细胞发生铁死亡。从形态学方面来说,铁死亡与其他细胞死亡方式的不同主要表现在细胞中的线粒体萎缩,细胞核却依然保持完整[8]。具体表现为细胞膜破裂,线粒体内形成气泡随后萎缩,线粒体嵴收缩或消失,膜密度增加,此外,虽然细胞核形状正常,但缺少浓缩染色质[9-10]。从遗传基因方面看,铁死亡受到多种遗传因子调控,主要集中在脂质过氧化和铁稳态两方面。最新研究表明,表观遗传现象已被证实可调节包括铁调素在内的关键蛋白质铁代谢,表观遗传调控因子如DNA甲基化、组蛋白乙酰化和miRNA,积极地调节细胞铁稳态[11]。

2 脑卒中发病过程中铁死亡的发生机制

2.1 缺血性脑卒中发病过程中铁死亡的发生机制缺血性脑卒中(ischemic stroke,IS)是脑卒中最常见的类型,约占所有脑卒中的4/5[12]。由于缺血损伤,正常的大脑血供被破坏,产生了一系列生理、病理反应,包括线粒体死亡、坏死、炎症、自由基释放和神经元过度兴奋等,进而导致神经元死亡[13]。越来越多的研究表明,铁死亡是缺血性脑卒中病理性细胞死亡的重要机制。

2.1.1 铁超载在大脑缺血的条件下,脑中所需的氧气水平不断增加,在氧的运输过程中,铁起着关键作用[14]。大脑中铁的输入、储存和输出受到严格的调控,其中任何步骤的改变都有可能使大脑中的铁稳态被扰乱,从而引发铁的神经毒性[15]。缺血性脑卒中触发铁超载的途径是大脑外源性的[16],无外乎两种情况:其一,铁输入过多。转铁蛋白(transferrin,TRF)是负责铁转运的主要蛋白质。有研究表明,转铁蛋白在低pH水平时对铁的结合亲和力会降低,导致铁从转铁蛋白中解离,解离后未结合的铁将从细胞外空间被运输到神经元中,从而导致神经元细胞内铁水平增加,进而造成神经元铁死亡[17]。其二,铁输出减少。膜铁转运蛋白1(ferroportin 1,FPN1)是一种跨膜蛋白,是唯一能够从细胞中输出铁的蛋白质[18]。FPN1在脑中主要在大脑皮层,海马和小脑的神经元中表达[19]。脑细胞内的铁流出是由FPN1所介导。Li等[20]研究发现脑缺血后大脑皮层和海马中FPN1表达下调,由此可见缺血性脑卒中发生后,FPN1表达的减少可能导致神经元中铁的积累,并进一步导致神经元死亡。

2.1.2 脂质过氧化和脂质代谢铁对于神经系统中髓鞘化和神经递质生物合成至关重要,其常常以Fe2+和Fe3+的形式存在[21]。氧化损伤和抗氧化防御之间的失衡是铁死亡的核心环节,而ROS引起脂质过氧化物的积累和氧化还原失衡是铁死亡发生和调控的关键[22]。从生理上讲,由于血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)提供的保护,大脑可以免受全身铁波动的影响。然而,在急性缺血条件下,血脑屏障被破坏,这允许游离铁和铁蛋白进入脑实质,通过Fenton反应将过氧化氢转化为羟基自由基[23]。该过程显著增加ROS的产生,其促进核酸、蛋白质组和膜损伤,并最终介导铁性细胞死亡[24]。具体来说,当铁超载致使抗氧化系统不堪重负时,过量的自由基靶向促进敏感脂肪酸过氧化,损害了脂质膜的完整性并诱导自杀信号级联[25]。此外,还引起溶酶体膜透化和氧化还原活性铁释放到细胞质中,这反过来又促进Fenton自由基的产生、细胞膜变性和GSH耗竭[26]。

脑细胞中的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)主要存在于细胞膜上,对氧化非常敏感,可导致脂质过氧化氢(lipid hydrogen peroxide,LOOH)和ROS的积累[27]。脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是一类以多不饱和脂肪酸为底物的含铁酶类,催化磷脂膜中多不饱和脂肪酸,最终形成磷脂氢过氧化物(phospholipid hydroperoxide,PLOOH),从而引起脂质过氧化,诱发铁死亡[28]。缺血性脑卒中发生后,脂氧合酶高度表达,其中以脂氧合酶亚型12/15-LOX与神经元铁死亡关系最为密切,抑制12/15-LOX可抑制铁死亡发生[29]。另有研究表明长链酯酰辅酶A合成酶4(long-chain acyl-CoA synthetase 4,ACSL4)与溶血卵磷脂酰基转移酶3(recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)参与磷脂酰乙醇胺的合成与重塑,故而影响脂质过氧化物的合成,抑制其表达从而抑制铁死亡发生[30]。ACSL4于脑组织中广泛表达,脑缺血期间ACSL4的表达明显增加[31]。

2.1.3 抗氧化剂耗竭、失活神经元膜富含多不饱和脂肪酸,很容易被氧化,因此大脑中抗氧化剂的平衡十分重要[32]。GSH和GPX4是抗氧化体系中具有代表性的标志物。GSH是细胞内唯一的Fe2+配体,能阻断Fe2+生成高毒性的羟基自由基从而抑制铁死亡[33]。GPX4是一种独特的抗氧化防御酶,通过减少膜磷脂氢过氧化物抑制脂质过氧化[11]。GSH是GPX4活性的必需物。有研究认为,铁死亡本质是GSH的耗竭导致GPX4活性下降,脂质过氧化物不能通过GPX4催化的谷胱甘肽还原酶反应代谢,随后Fe2+氧化脂质产生活性氧,从而促使铁死亡的发生[34-35]。缺血性脑卒中发生时常伴随氧化应激,当机体出现氧化应激反应时,机体会产生GPX4等物质启动抗氧化防御机制防止这种损害[36],从而减轻细胞的脂质过氧化。同样,抗氧化酶的缺乏反过来会导致铁的积累。在缺血性中风的小鼠模型中,已经鉴定出神经元中降低的GSH和GPX4活性,伴随着增强的脂质过氧化[37]。

2.1.4 system Xc-抑制半胱氨酸/谷氨酸逆向转运体(cystine/glutamate antiporter,system Xc-)是一种氨基酸抗转运蛋白,由两个核心成分组成:溶质载体家族7成员11(recombinant solute carrier family 7,member 11,SLC7A11)和溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member A2,SLC3A2)。system Xc-存在于细胞膜,其主要功能是将细胞外的胱氨酸(cystine,Cys)转移至细胞内,并将细胞内的谷氨酸(glutamic acid,Glu)转至细胞外,通常按 11 的比例转运[3],这种转运是由细胞内高浓度的谷氨酸所驱动的。膜转运蛋白SLC7A11将细胞外的胱氨酸转运入细胞内,胱氨酸被进一步转化为半胱氨酸,参与GSH的生成。在GSH存在的条件下,GPX4催化GSH和脂质过氧化物反应高效地清除细胞内蓄积的脂质过氧化物,避免细胞发生铁死亡,维持细胞的正常生理功能[38]。缺血性脑卒中后,细胞对谷氨酸的摄取量降低,细胞外囊泡和非囊泡谷氨酸的释放量增加,造成细胞外谷氨酸水平不断升高[39],高浓度的谷氨酸会产生兴奋性毒性从而导致system Xc-被抑制,进而引发神经细胞铁死亡[27]。

2.2 出血性脑卒中发病过程中铁死亡的发生机制出血性脑卒中又名脑出血(intracerebralhemorrhage,ICH),虽然其仅占脑卒中的10%～30%,但其病死率和致残率高于缺血性脑卒中[12]。出血性脑卒中的脑损伤可大致分为两个阶段:原发性损伤和继发性损伤。其中原发性损伤主要是由血肿压迫和颅内压升高所造成的,当出血情况稳定后,便出现继发性损伤如炎症、水肿、血红蛋白降解和细胞死亡代谢物的毒性、血脑屏障的破坏等[16]。近年来许多研究证实出血性脑卒中与铁死亡相关。

2.2.1 铁超载出血性脑卒中的铁超载主要发生在脑内,属于内源性[16]。出血性脑卒中时,脑血管破裂形成血肿,随后压迫周围血管发生继发性破裂,从而引起占位效应性血肿范围扩大[40]。血肿中积聚了大量的红细胞,然后这些红细胞发生溶解,释放血红蛋白,这样的过程通常会持续数月[41]。血红蛋白进一步分解后形成血红素,血红素通过受体进入细胞内。在血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1) 的作用下,血红素降解为一氧化碳、胆红素和Fe2+,导致细胞内铁超载,从而发生铁死亡,成为继发性脑损伤和神经元死亡的主要原因[42]。

有学者研究发现,出血性脑卒中发病过程中的铁超载还有其他原因:脑出血后出现炎症,激活了TLR4/MyD88信号通路,从而促进白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表达;同时通过JAK/STAT3途径使铁调素表达上调,进而阻止了脑组织铁流出,导致铁超载[43]。

2.2.2 抗氧化系统受损出血性脑卒中发生时,脑铁水平、ROS水平会在短时间内迅速上升[44],铁超载大量消耗GSH,致使抗氧化系统不堪重负,从而导致GPX4活性降低。Zhang等[41]研究发现在出血性脑卒中后的24 h,大鼠脑内的GPX4达到最低水平,并且检测表明主要在神经细胞中GPX4表达下调,说明此时神经细胞的抗氧化能力明显降低。

2.2.3 花生四烯酸5脂加氧酶(arachidonate 5-lipoxygenase,ALOX5)活性增高ALOX5是LOX亚型之一,在出血性脑卒中时,ALOX5的表达明显增高,其与多不饱和脂肪酸反应,生成过氧化脂质,从而引发神经元细胞铁死亡[45]。

3 针刺干预脑卒中相关铁死亡研究进展

在目前的研究中,针刺直接调控脑卒中相关铁死亡机制的研究还较少,针刺调控脑内铁代谢、抗氧化相关指标的研究较为常见。脑内的铁代谢异常、过氧化都与铁死亡发生息息相关,因此针刺对铁代谢、过氧化的调控机制都对针刺调控铁死亡的机制研究有重要意义。目前常见的相关针刺治疗方式主要有电针、头皮针、针刺及针药结合等。

3.1 电针电针是传统针灸和现代电刺激相结合的产物,目前已在临床上广泛应用。电针可改善患者的神经功能,提高患者的生活质量[46]。电针对人体的刺激较强,而且较为稳定,可以同时应用于多个目标。最近研究表明,电针可以抗凋亡、抗炎、抑制自噬、降低抗氧化应激、促进神经干细胞的增殖和分化以及神经血管单元重塑[47]。目前在对脑卒中治疗的研究中,电针对脑卒中铁死亡调控的作用机制相对明确。Liang等[48]对脑缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)急性期大鼠进行电针预处理,检测铁代谢和氧化应激相关蛋白,结果表明电针预处理可恢复脑缺血再灌注后大脑中 FPN-1 的表达水平,提高GSH和GPX4表达,降低ROS表达,从而得出结论:电针可以通过调节铁代谢降低脑缺血再灌注氧化应激发挥神经保护作用。Li等[47]研究电针对大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠铁死亡的抑制作用,研究结果表明电针可以显著提高GPX4和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性以及GSH的水平,并减少丙二醛(malondialdehyde,MDA)和铁的积累。其中SOD是抗氧化系统的重要酶类之一,MDA是多不饱和脂肪酸过氧化物的降解产物,其含量反映氧化应激水平,并在一定程度上介导铁死亡[49]。梁润昱[50]研究显示电针及电针预处理能够调控脑缺血再灌注后铁代谢,减少铁超载从而减轻氧化应激损伤,发挥神经保护作用。李笑笑等[51]研究发现电针可减轻糖氧剥夺/复氧(oxygenglucose deprivation and reperfusion,OGD/R)诱导的海马神经元损伤,抑制神经元铁死亡。

3.2 头皮针头皮针在促进急性出血性脑卒中后临床神经功能缺损和肢体瘫痪的恢复方面有效且安全[52]。有Meta分析研究显示,头皮针透刺百会是急性出血性脑卒中的潜在有效治疗选择[53]。目前头皮针对脑卒中铁死亡的研究主要集中在出血性脑卒中后的治疗方面。Li等[54]对自体血液注射诱导的出血性脑卒中鼠模型进行了头皮针疗法的预防作用研究,结果显示头皮针治疗可增加神经细胞线粒体外膜直径,降低细胞内MDA和Fe2+的含量,抑制神经元铁死亡,其机制可能是通过促进p62/Keap1/Nrf2抗氧化信号通路引起GPX4和铁蛋白重链多肽1(ferritin heavy polypeptide 1,FTH1)上调,从而增强出血性脑卒中后的恢复。Kong等[55]研究表明透刺百会、曲鬓穴可使GPX4和HO-1表达增加,ROS累积减少,从而减轻脑出血后神经元细胞铁死亡,其机制可能是通过下调miR-23a-3p实现。李明月等[56]同样选择百会透曲鬓的针刺疗法对脑出血大鼠进行治疗,认为针刺可能通过抑制脑出血大鼠神经细胞铁死亡促进出血大鼠神经功能修复。

3.3 针刺及针药结合大量研究已经证实,在脑卒中相关的神经功能障碍疾病中,针刺治疗有效且安全[57]。目前针刺直接调控脑卒中铁死亡机制的相关研究较少,汪红娟等[58]用线栓法制备65只大鼠MCAO模型,2 h后拔出线栓从而建立脑缺血再灌注模型,选取人中、大椎、百会穴进行捆绑针刺,留针30 min,12 h 1次,共治疗7次,实验后得出结论:针刺可以调节神经细胞Fe2+代谢,减轻海马组织Fe2+集聚,减少脂质过氧化,从而抑制 CIRI 后大鼠神经细胞铁死亡,发挥脑保护作用。张琦等[59]研究发现醒脑开窍针刺法联合阿替普酶可减轻急性脑梗死患者大脑中脂质过氧化的表达。

研究显示,在病理状态下,针刺能够增强脑组织的抗氧化能力,通过促进脑组织中过氧化氢酶(catalase,CAT)、SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等抗氧化酶释放来改善自由基代谢,进而减轻氧化应激[60-61]。孙培养等[62]研究表明通督调神针刺可提高脑卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)大鼠海马CA1区SOD、CAT活性,降低MDA含量,抑制海马神经组织氧化应激。舒兆瑞[63]研究显示针刺配合常规治疗可改善急性缺血性脑卒中患者神经功能修复,改善血浆自由基水平,这可能与SOD活性升高有关。张天仁[64]研究发现针刺联合人参提高了GSH、GSH-Px、SOD活性,加强了抗氧化能力,缓解了大鼠慢性疲劳。脂质过氧化是铁死亡的特征之一,其中SOD、MDA、GSH-Px与脂质过氧化联系紧密,GSH更是铁死亡代表标志物之一,这对针刺治疗脑卒中铁死亡机制有很大的借鉴意义。

4 结语

综上所述,脑卒中发病过程中铁死亡的发生机制主要与铁超载、脂质过氧化、兴奋性毒性、抗氧化酶失活及系统受损等有关。缺血性脑卒中和出血性脑卒中发病过程中铁死亡的发生机制还存在某些差异,例如脂氧合酶类表达的亚型不同:缺血性脑卒中12/15-LOX高表达,而出血性脑卒中ALOX5的表达明显增高。且铁过载产生的机制亦有区别。因此在不同情况下,针刺治疗方案的选择需有所不同。目前针刺调控脑卒中相关铁死亡的研究尚处在前期阶段,其具体机制尚未明确,需要进一步的研究探索,且当下研究多以动物实验为主,缺乏临床实践验证,这是未来针刺研究的一大挑战。这些问题若能得到解决,则有望为脑卒中的治疗提供重要的思路及新的靶点。