健脾活血中药抗肝纤维化的体外实验研究

梅文馨，胡高斌，彭 辉，经文善，黄 龙，于庆生

(1.安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031；2.安徽省中医药科学院中医外科研究所,安徽 合肥 230031)

肝纤维化是由饮酒、代谢障碍和病毒等引起的慢性肝损伤的过程，是一种可逆的创伤愈合反应[1]。在肝脏持续损伤过程中，慢性炎症和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的持续积累导致肝实质逐渐被瘢痕组织替代，最终导致肝硬化。许多类型的细胞、细胞因子和miRNA均参与肝纤维化和肝硬化的进程，如库普弗细胞、肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)、血小板源性生长因子、转化生长因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)[2-3]。肝纤维化的发展与HSCs的激活密切相关，在肝脏慢性损伤发展过程中，静止的HSCs被激活，并进一步分化成肌成纤维细胞，分泌大量以Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白为主的ECM。因此，抑制HSCs的激活成为改善肝纤维化的研究热点[4]。前期研究[5]发现，健脾活血中药能明显提升门静脉高压合并脾功能亢进脾切除患者术后肝脏血液供应，改善肝功能。因此，笔者推测健脾活血中药在改善肝功能的同时，能进一步改善肝纤维化。本研究通过细胞实验观察健脾活血中药对HSCs的主要纤维化指标的影响，探究其改善肝纤维化的机制。

1 材料

1.1 细胞与试剂 人HSCs细胞系LX-2(货号 CC4023)：上海细胞所；高糖DMEM培养基(货号 01-052-1ACS)：以色列Biological Industries公司；澳洲胎牛血清(fetal bovine serum, FBS；货号 10099-141C)、胰蛋白酶(货号 25200-072)、双抗[青霉素+链霉素(P.S)；货号 15140-122]：美国Gibco公司；TGF-β1试剂盒(货号 240-B-002)：美国R&D Systems；一抗内参(GAPDH；货号 60004-1-Ig)：武汉三鹰生物技术有限公司；一抗[α平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA；货号 380653)、胶原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ，Col-Ⅰ；货号 R26615)、胶原蛋白Ⅲ(collagen Ⅲ，Col-Ⅲ；货号 R23957)：正能生物；二抗山羊抗兔IgG(货号 ZF-2301)、山羊抗鼠IgG(货号 ZF-2305)：中杉金桥；荧光二抗山羊抗兔(货号 A21428)：美国Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8增强型试剂盒、Triton-100、抗荧光淬灭剂(含DAPI)、SDS裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、SDS-PAGE电泳液(10×)、Western blot转膜液、吐温-20：上海碧云天生物技术有限公司；TBS缓冲液(即用型干粉)：合肥白鲨生物科技有限公司；极超敏ECL化学发光试剂盒：山东思科捷生物技术有限公司。

1.2 主要仪器 转膜仪、电泳仪(PowerPac 系列)：Bio-Rad；细胞培养箱(3111型)：Thermo；酶标仪(SpectraMax iD3)：美谷分子仪器(上海)有限公司；冻干机(BXXW-LGJ-10)：北京博翔兴旺科技；荧光显微镜(BX51)：Olympus。

2 方法

2.1 细胞培养及传代 用含10% FBS、1% P.S的高糖DMEM(完全培养基)将细胞培养在37 ℃、5% CO2的无菌环境中，待细胞密度达到90%左右时，吸去原培养基，磷酸盐缓冲液清洗2次，每90 mm培养皿加入1 mL胰酶，在培养箱中孵育1～2 min后，加入2 mL完全培养基终止消化，吹打后移入15 mL离心管，5 000 r/min离心5 min，吸去上层培养基，加入2 mL完全培养基，轻轻吹打，混匀后分别移入1 mL至新的培养皿中，补足每皿完全培养基至6 mL，混匀后移入培养箱。

2.2 冻干粉制作 健脾活血中药(黄芪、白术各30 g，党参、茯苓、当归、熟地黄、白芍各20 g，川芎、桃仁、红花各10 g)由安徽中医药大学第一附属医院提供。将所有药材放入煎药壶中，加入1 000 mL纯水，浸泡30 min后加热煎药，水沸后继续煎煮浓缩至100 mL，则最终药物浓度为1.9 g/mL。冷却过滤后分装至90 mm培养皿中，覆盖保鲜膜，表面戳孔，并放入-80 ℃冰箱冷冻。在真空冷冻干燥机中预冷至-50 ℃，将凝结后的药液放入冻干机中，真空低温干燥48 h后制成健脾活血中药冻干粉(每克冻干粉相当于原药材9.5 g)，将制作好的冻干粉分装至冻存管中，-80 ℃冰箱冷冻备用，使用时用完全培养基充分溶解后用0.22 μm滤头过滤。

2.3 CCK-8检测LX-2细胞活力 在96孔板中，每孔接种LX-2细胞100 μL，培养过夜后，加入5 ng/mL的TGF-β1诱导48 h，吸去原培养基，每孔加入100 μL不含FBS的培养基，待细胞饥饿4 h后，再向每孔加入100 μL含FBS及健脾活血中药冻干粉的培养基，使每孔最终含10% FBS，分别含有0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL健脾活血中药冻干粉，培养48 h，每个浓度设3个复孔，实验重复3次，其中0为对照组。因中药冻干粉溶解后颜色较深，每3个复孔后均设立1个与上述浓度一致的不含细胞的空白组，实验结束后向每孔加入20 μL CCK-8试剂，继续孵育3 h后，酶标仪检测450 nm处吸光度(optical density,OD)值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=(实验组OD值-对照组OD值)/对照组OD值×100%。

2.4 Western blot法检测健脾活血中药冻干粉对Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表达水平的影响 用6孔板对细胞进行培养，待细胞密度达80%后，吸去原培养基，PBS清洗2次；对照组只加入完全培养基(高糖DMEM含10% FBS、1% P.S)，模型组加入含5 ng/mL TGF-β1的完全培养基，中药组加入含5 ng/mL TGF-β1和1.5 mg/mL健脾活血中药冻干粉的完全培养基；培养48 h后，消化，离心，去除培养基；每孔细胞加入100 μL SDS裂解液(含1% PMSF)，冰上裂解30 min后，离心，取上清，进行BCA蛋白定量检测。按4∶1加入5×上样缓冲液，100 ℃加热8 min，将变性后的蛋白样品按每孔20 μg进行凝胶电泳、转膜、封闭，加一抗在4 ℃下孵育过夜，加二抗在常温下孵育1.5 h，每个步骤结束后均用TBST清洗3次，每次5 min，然后使用化学发光法检测条带，并用Image J(1.52a)分析Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA条带的灰度值。

2.5 免疫荧光法检测健脾活血中药冻干粉对Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表达水平的影响 在提前放置好细胞爬片的12孔板中接种(1～2)×105个细胞，培养过夜后按照上述分组依次处理细胞，细胞处理结束后用PBS清洗2次，然后进行固定、通透、封闭，封闭结束后加一抗孵育过夜，加荧光二抗后避光孵育，每个步骤结束后均用PBS清洗3次，每次5 min。封片前在载玻片上滴加1滴含DAPI的抗荧光淬灭剂，细胞面朝下盖好爬片，用透明指甲油封边，在荧光显微镜下检测结果，并用Image J(1.52a)分析Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA的荧光表达量。

3 结果

3.1 健脾活血中药冻干粉对LX-2细胞增殖率的影响 培养48 h后，不同浓度健脾活血中药冻干粉对LX-2细胞增殖率的影响呈现先促进后抑制的效应，浓度为1.5 mg/mL时LX-2细胞增殖率达到峰值，浓度达到2.0、2.5、3.0 mg/mL时LX-2细胞增殖率显著降低。见图1。因此，后续实验采用1.5 mg/mL作为最佳实验浓度。

注：与健脾活血中药冻干粉0 mg/mL组比较，*P<0.05；与健脾活血中药冻干粉1.5 mg/mL组比较，#P<0.05

3.2 Western blot法检测的3组LX-2细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA相对表达水平比较 与对照组比较，模型组LX-2细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组LX-2细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表达水平显著降低(P<0.05)。见图2。

注：A.对照组；B.模型组；C.中药组；与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.3 免疫荧光法检测的3组LX-2细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表达水平比较 与对照组比较，模型组LX-2细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表达水平显著升高(P<0.05)；与模型组比较，中药组LX-2细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA表达水平显著降低(P<0.05)。见图3、图4、图5、图6。

图3 3组LX-2细胞中Col-Ⅰ表达水平(免疫荧光染色，10×20倍)

图4 3组LX-2细胞中Col-Ⅲ表达水平(免疫荧光染色，10×20倍)

图5 3组LX-2细胞中α-SMA表达水平(免疫荧光染色，10×20倍)

注:与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

4 讨论

HSCs在肝纤维化进程中发挥着重要作用[6]。静息状态下HSCs被TGF-β1所激活，存在于窦周间隙(Disse间隙)Ⅳ型、Ⅵ型胶原蛋白被Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白取代。α-SMA蛋白表达水平大幅升高，随着纤维化的发展，大量活化的HSCs和肌成纤维细胞的收缩性促进肝窦的收缩，影响血流和营养物质的交换，可进一步导致肝功能障碍，加速疾病的发展[4,7]。

目前国内对肝纤维化的研究甚多，而中药作用的广泛性更为肝纤维化的治疗提供了新思路。如郭茜等[8]发现，连翘酯苷A不仅可以改善肝纤维化小鼠的肝功能，也能降低肝脏中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表达水平。刘近明等[9]发现，四逆软肝方能抑制LX-2细胞的活化，显著降低LX-2细胞中基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitors of metalloprotinase,TIMP-1)蛋白的表达水平，促进ECM的降解。卢金等[10]发现，小柴胡汤可以抑制LX-2细胞增殖，降低Col-Ⅰ的表达水平。陈黎旭等[11]发现，扶正化瘀胶囊含药血清可促进HSCs的氧化应激反应，抑制HSCs的活化。同时，也有学者[12-13]对中药调节肝纤维化相关的信号通路和miRNA展开研究。

中药在抑制HSCs激活，减轻炎症反应，改善肝纤维化方面疗效甚佳[14]。健脾活血治法中，健脾之法借鉴李东垣《脾胃论》补中益气汤组方思想，选择黄芪、党参、茯苓、白术益气健脾；活血法吸收吴谦《医宗金鉴》桃红四物汤的组方要义，选择当归、川芎、桃仁、红花活血化瘀。方中黄芪可提高肝组织中基质金属蛋白酶1含量，降低TIMP1含量，减少ECM生成，改善肝纤维化[15]。桃红四物汤可以提高CCl4诱导的肝纤维化小鼠肝组织中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性，对肝纤维化具有延缓作用[16]。本研究结果表明，健脾活血中药能显著抑制激活后LX-2细胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、α-SMA的表达，改善LX-2细胞的纤维化。但健脾活血中药抑制肝纤维化指标表达的具体机制尚不明确，是否与细胞因子或miRNA介导的信号通路相关，尚需进一步研究。