甘草酸对感染人巨细胞病毒的人胚肺成纤维细胞凋亡和炎性反应的影响

沈利霞, 苏贤凤

(四川省广安市人民医院 药剂科, 四川 广安, 638000)

人巨细胞病毒(HCMV)是一种广泛存在于哺乳动物中的病毒感染因子[1]。研究[2-3]表明, HCMV是先天性感染的主要病原体之一，发展中国家成年人和大龄儿童的感染率高达95%左右，感染可累及肝、肾、肺、肠等脏器，健康人一般表现为潜伏感染或无症状的亚临床感染，但在免疫缺陷综合征、器官移植患者和新生儿等免疫功能低下人群中，HCMV感染常引起严重的多系统病变，甚至造成死亡。甘草酸是中药甘草根部的提取物，是甘草最主要的活性成分，可溶于水，味甜，可用作调味剂、甜味剂和香味增强剂。现代药理学研究[4]表明，甘草酸具有抗氧化、抑菌、消炎、抗病毒等多种生物活性。另有研究[5]表明，甘草酸具有抗HCMV的效应。细胞凋亡是HCMV感染致病的重要机制之一，而HCMV感染宿主细胞后还可与机体免疫系统相互作用，诱导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)等促炎信号分子产生，引发机体炎性反应，为其自身复制和传播创造有利的微环境[6]。本研究探讨甘草酸对感染HCMV的人胚肺成纤维细胞增殖、凋亡和炎性反应情况的影响，以期为甘草酸在抗HCMV中的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

HCMV AD169株购自美国模式培养物集存库(ATCC); 人胚肺成纤维细胞株MRC-5购自中国科学院上海细胞库; 注射用更昔洛韦购自武汉长联来福制药股份有限公司，0.25 g/瓶，批号H20066700; 甘草酸购自北京坛墨质检科技有限公司，20 mg/支，批号20140818; CCK8试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司; 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)凋亡检测试剂盒购自翌圣生物科技股份有限公司; 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)一抗、活化Caspase3(Cleaved-caspase3)一抗、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗、IL-6一抗、TNF-α一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国Abcam公司; 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

将人胚肺成纤维细胞MRC-5培养于含10%胎牛血清和1%青霉素与链霉素双抗的MEM培养基，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，密切观察细胞生长状况，当细胞达到80%融合时，用0.25%胰酶消化离心，进行传代。

1.3 病毒感染及分组

取对数生长期的MRC-5细胞，加入胰酶消化后，制成单细胞悬液，接种于96孔板中。将细胞随机分为6组，即对照组、病毒组、更昔洛韦组(50 μg/mL, 阳性对照组)、甘草酸低剂量组(0.25 mg/mL)、甘草酸中剂量组(0.50 mg/mL)、甘草酸高剂量组(1.00 mg/mL)[6]。对照组用未处理培养液培养，其余5组先用接种100 TCID50剂量AD169毒株的培养液培养1.5 h, 然后更换含有对应药物的培养基，每组实验均设置9个复孔。所有细胞置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.4 CCK8实验检测细胞增殖活性

取生长至对数期的MRC-5细胞，经胰酶消化后用培养基稀释为密度1×104个/mL的细胞悬液，然后接种于96孔板中，每孔200 μL, 待细胞贴壁后，按上述分组接种病毒和相应药物，放置于含有5%CO2的37 ℃恒温培养箱中培养，1.5 h后更换培养液培养。分别于培养24、48、72 h时向每孔加入20 μL的CCK8溶液孵育4 h, 然后在酶标仪上检测每孔的光密度(OD)值。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡情况

取对数生长期的MRC-5细胞，经胰酶消化后制成密度为3×105个/mL的单细胞悬液，接种于6孔板中，待细胞贴壁后，按上述分组接种病毒和相应药物，在含有5%CO2的37 ℃恒温细胞培养箱中培养, 1.5 h后更换培养液培养。分别于培养24、48、72 h时加入胰酶消化细胞，重悬细胞并调整密度为1×105个/mL, 在流式管中加入细胞悬液100 μL、Annexin V-FITC染液5 μL、PI溶液5 μL, 避光染色30 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并计算总凋亡率。

1.6 蛋白质印迹法(Western blot)检测凋亡蛋白Caspase3的表达

于各组细胞经HCMV感染后48 h收集细胞，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度。取适量蛋白样本煮沸变性，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，转移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。将膜在含5%脱脂奶粉的封闭液中固定2 h，然后分别与Caspase3(1∶1 000)、Cleaved-caspase3(1∶1 000)、TNF-α(1∶1 000)、IL-6(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗稀释液于4 ℃下孵育过夜，再与辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液(1∶2 000)于室温下孵育2 h, 最后于ECL试剂中避光显色，凝胶成像系统下曝光、拍照。使用凝胶图片处理软件Image J分析目的蛋白条带的灰度值，并计算Cleaved-caspase3和Caspase3总蛋白(Total-caspase3)相对表达量。

1.7 ELISA检测细胞培养上清液中炎性因子水平

于各组细胞经HCMV感染24、48、72 h时，分别收集细胞培养上清液，使用ELISA试剂盒检测上清液中TNF-α、IL-6水平。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 甘草酸对感染HCMV的MRC-5细胞增殖活性(OD450 nm)的影响

CCK8实验结果显示，经HCMV感染24 h时，各组细胞增殖活性比较，差异无统计学意义(P>0.05); 经HCMV感染48、72 h时，病毒组细胞的增殖活性均低于对照组，更昔洛韦组、甘草酸中剂量组、甘草酸高剂量组细胞的增殖活性均高于病毒组，差异有统计学意义(P<0.05); 甘草酸低剂量组与病毒组比较，甘草酸中剂量组与甘草酸高剂量组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。因此，本研究选择甘草酸中剂量组(0.50 mg/mL)进行后续实验，并简称甘草酸组。

表1 HCMV感染后不同时点各组细胞增殖活性比较

2.2 甘草酸对感染HCMV的MRC-5细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，经HCMV感染24 h时，各组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义(P>0.05); 经HCMV感染48、72 h时，病毒组MRC-5细胞的凋亡率均高于对照组，更昔洛韦组、甘草酸组MRC-5细胞的凋亡率均低于病毒组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表2。

图1 流式细胞仪检测HCMV感染后不同时点各组细胞凋亡结果

表2 HCMV感染后不同时点各组细胞总凋亡率比较 %

2.3 甘草酸对感染HCMV的MRC-5细胞Caspase3表达的影响

Western blot检测结果显示，经HCMV感染48 h后，病毒组MRC-5细胞Cleaved-caspase3蛋白相对表达量高于对照组，更昔洛韦组、甘草酸组MRC-5细胞Cleaved-caspase3蛋白相对表达量低于病毒组，差异有统计学意义(P<0.05); 各组细胞Total-caspase3相对表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图2。

2.4 甘草酸对HCMV感染的MRC-5细胞炎性反应的影响

ELISA检测结果显示，经HCMV感染24、48、72 h时，病毒组MRC-5细胞TNF-α、IL-6水平均高于对照组，更昔洛韦组、甘草酸组MRC-5细胞的TNF-α、IL-6水平均低于病毒组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 各组细胞Cleaved-caspase3和Total-caspase3蛋白相对表达量比较

A: Western blot检测结果; B: Cleaved-caspase3和Total-caspase3表达情况(与对照组比较, *P<0.05; 与病毒组比较, #P<0.05)。图2 Western blot检测细胞中Cleaved-caspase3和Total-caspase3蛋白表达情况

Western blot检测结果显示，经HCMV感染48 h后，病毒组MRC-5细胞TNF-α、IL-6蛋白相对表达量均高于对照组，更昔洛韦组、甘草酸组MRC-5细胞TNF-α、IL-6蛋白相对表达量均低于病毒组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、图3。

表4 HCMV感染后不同时点各组细胞培养液中TNF-α、IL-6水平比较 pg/mL

表5 各组细胞TNF-α、IL-6蛋白相对表达量比较

3 讨 论

HCMV是一种疱疹病毒组DNA病毒，分布广泛，成人感染率极高，感染主要累及肺、肝、肠等脏器，对于免疫缺陷综合征患者、新生儿及器官移植者而言, HCMV感染可引发严重的临床症状，甚至导致死亡[7]。研究[8]表明, HCMV感染可诱导宿主细胞发生凋亡，并抑制宿主细胞增殖。细胞凋亡是在生理条件下由基因控制的程序性细胞死亡，在维持机体内环境稳定方面起着重要作用[9]。因此，寻找针对HCMV的新型抗病毒药物依然是病毒学研究中的重要任务。甘草酸是一种广谱抗冠状病毒候选物，具有抗病毒、抗氧化、抗炎、保护肝脏等多种生物活性[10], 目前已被普遍使用于临床。相关研究[11-12]表明，甘草酸具有优异的抗病毒活性，能够通过阻碍病毒与宿主细胞相互作用而阻断严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的感染，且甘草酸与绿原酸联合用药能够对呼吸道合胞病毒(RSV)产生较好的抑制作用。本研究通过CCK8实验和流式细胞术对甘草酸作用下MRC-5细胞增殖和凋亡情况进行检测，结果发现，经HCMV感染24 h时，细胞增殖和凋亡情况均无明显变化，但感染48 h后细胞增殖活性显著降低，细胞凋亡率显著升高，而甘草酸能够有效促进感染HCMV的MRC-5细胞增殖，抑制HCMV感染诱导的细胞凋亡，作用与更昔洛韦一致。

A: Western blot检测结果; B: TNF-α和IL-6表达情况(与对照组比较, *P<0.05; 与病毒组比较, #P<0.05)。图3 Western blot检测各组细胞中TNF-α和IL-6蛋白表达情况

Caspase3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶, Caspase3的活化在促进细胞凋亡中起着不可替代的作用[13]。本研究检测HCMV感染48 h时细胞中Total-caspase3和Cleaved-caspase3蛋白表达情况，结果与细胞凋亡检测结果一致。病毒需要利用宿主细胞完成其自身的复制和增殖，因此感染早期是通过阻止Caspase3的活化而阻止宿主细胞凋亡，感染后期则是通过活化Caspase3诱导宿主细胞凋亡而使其发生致病效应。HCMV原发感染多为无症状的潜伏感染，通常可被机体免疫系统有效控制而不致病，但当机体免疫功能降低时，病毒再激活，可引起机体多器官炎症反应及功能障碍。研究[14-15]表明，HCMV在宿主细胞内的增殖复制，可导致TNF-α和IL-6等炎性因子表达，引起炎症性疾病的发生。本研究结果发现, HCMV在感染MRC-5细胞24 h时即可引起细胞TNF-α、IL-6分泌水平升高，而甘草酸对HCMV感染引起的炎性因子高水平具有抑制作用。

综上所述，甘草酸能够促进感染HCMV的人胚肺成纤维细胞增殖，抑制HCMV感染诱导的细胞凋亡和细胞炎性反应，这为甘草酸应用于HCMV感染性肺疾病的临床治疗提供了实验依据，对临床抗HCMV治疗和预防具有指导意义。但甘草酸对抗HCMV感染引起的人胚肺成纤维细胞凋亡和炎症反应的具体机制及其临床应用效果尚未明确，未来有待进一步深入探讨。