二甲双胍抑制人宫颈鳞癌细胞系SiHa和CaSKi增殖及促进细胞凋亡

刘婷婷，韩 超，赵小玲，孔为民

首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院 妇科肿瘤科，北京 100006

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，仅2020年全球就有新发病例60.4万例，死亡病例34.2万例[1]。与发达国家相比，发展中国家宫颈癌的发病率及病死率均明显增加，中国和印度的病例数占全世界总病例数的1/3[2]。早期宫颈癌以手术治疗为主，中晚期宫颈癌以同步放化疗为主[3]。然而，严重的放化疗不良反应及化疗耐药的出现常常导致肿瘤复发和恶化，中晚期宫颈癌的5年生存率仅为40%～50%。寻找新的治疗方案具有重要的临床意义，也成为亟待解决的热点问题。

二甲双胍(metformin,Met)是治疗2型糖尿病最常用的降糖药物。2005年，Evans等[4]首次发现其可以降低糖尿病患者的肿瘤发病率。这一发现，使越来越多的学者关注到二甲双胍在恶性肿瘤治疗中的价值，它可以剂量依赖地抑制多种恶性肿瘤细胞的增殖，减少侵袭和转移[5]。然而，二甲双胍对宫颈癌的作用如何尚存在争议，对其作用机制的了解更为有限。因宫颈癌中鳞状细胞癌约占80%[6]，本研究选取宫颈鳞癌细胞系SiHa、CaSki为研究对象，分析二甲双胍对宫颈鳞癌细胞增殖的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈鳞癌细胞系SiHa和CaSKi(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)；DMEM培养基、胎牛血清(Gibco公司)；CCK-8检测试剂盒、PI细胞周期试剂盒、annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗AMPK、p-AMPK、p70S6K、p-p70S6K、4E-BP1、p-4E-BP1单克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)；二甲双胍(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。选取处于对数期的细胞分为对照组和二甲双胍组，浓度分别为0.01、0.1、1、5、10、15、25、35和50 mmol/L。每组设3个复孔。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖：不同浓度二甲双胍干预后的细胞继续培养24、48 和72 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液继续培养2 h。培养终止后于450 nm处测量各孔的吸光值(Avalue)，计算细胞增殖率及IC50值。二甲双胍低浓度、中浓度及高浓度分别参考48 h的10%抑制浓度(IC10)、25%抑制浓度(IC25)及IC50，取临近值的整数值作为后续实验不同组采用的二甲双胍浓度。

细胞增殖率=(实验孔A-空白孔A)/(对照孔A-空白孔A)×100%

1.2.3 PI单染法检测细胞周期：消化后的细胞接种到6孔板中，细胞贴壁48 h后用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化，并收集细胞。细胞样品中加入PI染色液，每管0.5 mL，充分混匀，37 ℃避光温水浴30 min。用流式细胞仪检测红色荧光，波长488 nm。通过专用软件分析细胞DNA含量和光散射情况。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率：消化后的细胞接种到6孔板中，细胞贴壁48 h后，加入195 μL Annexin V-FITC结合液，将细胞充分混匀。加入10 μL PI染色液，充分混匀。培养10～20 min后放于冰水浴中，此过程注意避光。培养过程中，为改善染色的效果可以多次重悬细胞，一般2～3次。收集细胞后用流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。取凋亡图右上象限(早期凋亡率)+右下象限(晚期凋亡率)之和，计算细胞凋亡率。

1.2.5 Wertern blot检测AMPK-mTOR信号通路蛋白表达：消化完成后将细胞及培养液移至离心管中，1 000 r/min离心10 min，用于后续实验。根据不同的分组加入含不同浓度二甲双胍的培养基，作用48 h。通过配胶、样品裂解、上样、电泳、转移、染色和图像分析等步骤，检测不同处理组AMPK、p-AMPK、S6K、p-S6K、4E-BP1、p-4E-BP1蛋白表达情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 二甲双胍对宫颈鳞癌细胞增殖能力影响

二甲双胍对SiHa和CaSKi细胞的抑制作用呈现浓度和时间依赖性(图1，2)。SiHa细胞48 和72 h二甲双胍IC50值分别为(50.95±2.63)和(21.39±5.23)mmol/L，CaSKi细胞48 和72 h二甲双胍IC50值分别为(9.98±1.63)和(7.47±2.09)mmol/L。SiHa细胞低、中、高浓度组二甲双胍浓度分别选择2、10和50 mmol/L，CaSKi细胞分别为1、5和20 mmol/L。

*P<0.05，**P<0.01 compared with 0.01 mmol/L group图1 二甲双胍作用后SiHa细胞增殖曲线Fig 1 Proliferation curve of SiHa cells with metformin

*P<0.05，**P<0.01 compared with 0.01 mmol/L group图2 二甲双胍作用后CaSKi细胞增殖曲线Fig 2 Proliferation curve of CaSKi cells with metformin

2.2 二甲双胍对细胞周期分布的影响

随着二甲双胍浓度的增加，G2/M期细胞含量逐渐减少，S期细胞含量逐渐增加，细胞均阻滞于S期(图3，4)。

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图3 SiHa细胞的细胞周期各时相比例Fig 3 Proportion of cell cycle in SiHa cells with metformin

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group 图4 CaSKi细胞的细胞周期各时相比例Fig 4 Proportion of cell cycle in CaSKi cells

2.3 二甲双胍对细胞凋亡的影响

不同处理组的SiHa细胞和CaSKi细胞凋亡情况(图5，6)。随着二甲双胍浓度的增加，SiHa和CaSKi细胞凋亡率逐渐增加(图7，8)。

2.4 二甲双胍对AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，二甲双胍组p-AMPK表达量显著增加，而p-S6K、p-4E-BP1表达量减少(图9～12)。

3 讨论

二甲双胍的应用虽然能降低某些恶性肿瘤的发病风险， 并能改善预后[7-8]， 但其在宫颈癌中的应用效果却存在争议。临床研究方面，有报道指出使用二甲双胍可以提高宫颈癌患者的无进展生存期[9]，亦有学者认为它的使用与宫颈癌患者的生存结局之间并没有关联[10]。体外研究方面，一些实验发现二甲双胍对宫颈癌HeLa、HT-3和MS751细胞系无明显抑制作用[11]，亦有人指出二甲双胍对宫颈癌HeLa细胞增殖有明显的抑制作用[12]。本研究发现，二甲双胍可以时间剂量依赖性地抑制宫颈鳞癌细胞系SiHa及CaSKi增殖。在相同浓度、相同作用时间下，CaSKi细胞系对二甲双胍更为敏感。原因可能是CaSKi细胞系来源于宫颈癌小肠肠系膜转移组织，具有完整的人乳头瘤病毒 (human papilloma-virus，HPV)16基因组及HPV18相关序列，而SiHa细胞系来源于患者的原位组织样品，其癌基因p53和视网膜母细胞瘤蛋白上调，包含有整合的HPV16基因组[13]。细胞类型的特异性和癌相关基因的突变可能导致了两者对二甲双胍敏感性不同，具体原因还需要进一步研究论证。

图5 不同处理组SiHa细胞的凋亡Fig 5 Apoptosis of SiHa cells in different groups

图6 不同处理组CaSKi细胞的凋亡Fig 6 Apoptosis of CaSKi cells in different groups

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图7 不同处理组SiHa细胞的凋亡率Fig 7 Apoptosis rate of SiHa cells in different groups

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图8 不同处理组CaSKi细胞凋亡率Fig 8 Apoptosis rate of CaSKi cells in different groups

图9 SiHa细胞不同处理组的AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达Fig 9 Expressions of AMPK-mTOR signal pathway related proveins in different groups of SiHa cells

图10 CaSKi细胞不同处理组的AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达Fig 10 Expressions of AMPK-mTOR signal pathway related proveins in different groups of CaSKi cells

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图11 SiHa细胞不同处理组的AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达Fig 11 Expressions of AMPK-mTOR signal pathway related proveins in different groups of SiHa cells

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group图12 CaSKi细胞不同处理组的AMPK-mTOR信号通路相关蛋白表达Fig 12 Expressions of AMPK-mTOR signal pathway related proveins in different groups of CaSKi cells

诱导细胞凋亡和影响细胞周期分布是二甲双胍抑制宫颈癌细胞增殖可能的机制[14]。有研究发现二甲双胍将宫颈癌HeLa细胞阻滞于S和G2/M期[12]，也有学者指出，二甲双胍将宫颈癌CaSKi细胞系阻滞于G2/M期，将HeLa细胞系阻滞于G0/G1期[13]。本研究发现二甲双胍能促进宫颈鳞癌细胞凋亡的发生，并呈现浓度依赖性，将宫颈癌SiHa及CaSKi细胞阻滞于S期。造成阻滞于细胞周期不同阶段的原因可能与二甲双胍浓度、作用时间以及细胞膜上决定二甲双胍分布和吸收的有机阳离子转运体基因多样性有关，尚需进一步研究。二甲双胍抑制肿瘤细胞增殖的另一个重要机制是激活AMPK-mTOR信号通路。mTOR mRNA及其蛋白在宫颈癌组织中表达升高，这为二甲双胍可能通过激活AMPK-mTOR信号通路抑制宫颈癌细胞增殖提供了理论依据[15]。本研究发现，二甲双胍处理组通过p-AMPK表达量增加，进而抑制其下游蛋白S6K、4E-BP1的磷酸化。

综上所述，二甲双胍可以抑制宫颈鳞癌SiHa及CaSKi细胞系增殖，并且这种抑制作用呈现一定的时间剂量依赖性。二甲双胍对宫颈鳞癌细胞增殖的抑制作用可能是通过促进细胞凋亡、将细胞周期阻滞于S期、激活AMPK-mTOR信号通路实现的。